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重庆市江水中有机污染物细胞毒性分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：重庆市江水中有机污染物细胞毒性分析 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 4 文2：重庆市江水中有机污染物细胞毒性分析 5 1 材料与方法 5 2 结果 7 3 讨论 8 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 重庆市江水中有机污染物细胞毒性分析 文1：重庆市江水中有机污染物细胞毒性分析 重庆市是三峡库区最大的城市，嘉陵江和长江是重庆市的主要水源，研究水中有机污染物对哺乳动物体外培养细胞的毒性，对于评价三峡库区水源水对人群健康的影响十分必要。H4IIE细胞是研究有机污染物毒性常用的细胞株。本文从有机污染物对H4IIE细胞增殖的抑制和对7-乙氧基-3-异吩嗯唑酮·脱乙基酶(Ethoxy-Resorufin-O-Deethylase，EROD)的诱导两方面对2004～2005年重庆市主城区长江和嘉陵江段水中有机污染物的毒性进行了分析。 1 材料与方法 11 试剂和仪器 XAD-2树脂、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、7-乙氧基-3-异吩嗯唑酮(Ethoxy-Resorufin，ERF)、香豆素(美国Sigma公司)；2，3，7，8四氯二苯并-对-二恶英(tetrochlorodibenzo-p-dioxi，TCDD)标准品(美国Cambrige公司)；DMEM培养基、小牛血清(美国Hyclone公司)；自制不锈钢柱；旋转蒸发仪(上海申科机械研究所)；多用途酶标仪(美国Biotech公司) 12 水中有机污染物的萃取 选择重庆市主城区大溪沟作为嘉陵江的取水点，寸滩作为长江取水点，分别于2004年8月(丰水期)和2005年1月(枯水期)进行水样采集。在不锈钢柱中按树脂：江水=1∶2000(V∶V)的比例装填已活化的XAD-2树脂，将江水用玻璃纤维棉过滤除去水中悬浮物后通过不锈钢柱，控制流速为05～1倍柱体积／min。过柱完毕，用真空泵将柱中水份吸干，用丙酮：正己烷(1∶1)洗脱XAD-2树脂中吸附的有机污染物，旋转蒸发，氮气吹干后按1ml 二甲基亚砜(DMSO)中溶解50 L江水中有机污染物的比例将萃取的有机污染物溶于DMSO，-20℃保存。 13 MTT实验 H4IIE细胞按1×104／孔接种于96孔平底培养板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，培养基为含10％小牛血清的DMEM。加入溶于DMSO的有机污染物进行染毒，设立空白对照组、DMSO溶剂对照组、25，50，100，150，200，250倍污染物组，每个浓度每个时相点至少设6个平行孔。于暴露后的24，48，72h分别取培养板，将原培养液去除，换含20μl MTT(5mg／ml)的新鲜培养基200μl，再培养4h，去上清，加DMSO 200μl／孔，振摇5min，于酶标仪上490nm下，空白调零，测Dλ值，用Excel软件绘制细胞增殖曲线。 图1 不同浓度的2，3，7，8-TCDD标样对H4IIE细胞EROD酶诱导的剂量-效应曲线（略） 14 EROD实验 H4IIE细胞按1×104／孔接种于96孔平底培养板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，培养基为含10％小牛血清的DMEM。当细胞达到70％融合时加入溶于DMSO的075～40pg／25μl 的2，3，7，8-TCDD标准品，以及溶于DMSO的有机污染物进行染毒，染毒剂量分别为25，25，250倍污染物，加入DMSO的体积占终体积的05％，每个浓度每个时相点至少设6个平行孔。暴露72h后，去除原培养基，加入100μl 新鲜的含8μmol／L的ERF和10μmol／L的香豆素的培养基，继续培养60min。然后，将每孔中的培养基移入一新的96孔板的对应孔中，并加入130μl乙醇终止反应。于荧光酶标仪上535nm激发波长/590nm吸收波长条件下测反应终产物异吩嗯唑酮(Resorufin，RF)的荧光强度。用Origin60软件制定荧光强度与2，3，7，8-TCDD浓度间的剂量-效应曲线，并从标准曲线中求得每个水样相对于2，3，7，8-TCDD标准品的毒性当量(toxic equivalency，TEQ)值。 2 结果 21 水中有机污染物对H4IIE细胞增殖的影响 各水样处理H4IIE细胞后，H4IIE细胞的增殖随染毒时间和剂量的增加而呈下降趋势，其中72h 处理组剂量-效应关系最好。在48和72h 处理组200和250倍浓缩的2005年1月大溪沟水样和2005年1月寸滩水样对细胞增殖有抑制(P005，与溶剂对照组比较)，其他各种处理与对照比较，差异无统计学意义。从48和