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矽肺模型大鼠肺间质成纤维细胞MMP 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：矽肺模型大鼠肺间质成纤维细胞MMP 1 1材料和方法 2 1．1材料 2 1．2方法 2 文2：大鼠血管性痴呆模型 5 1 材料与方法 6 2 结 果 7 3 讨 论 8 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 矽肺模型大鼠肺间质成纤维细胞MMP 文1：矽肺模型大鼠肺间质成纤维细胞MMP 0引言 基质金属蛋白酶及其组织抑制物（matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, MMP/TIMP）是肺纤维化效应细胞分泌的生物活性分子，在细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成和降解中具有重要意义. 在MMP家族中，MMP2和MMP9的特异性底物主要是Ⅳ型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分. 肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化过程的关键事件［1］. 我们在SiO2所致肺纤维化形成过程中的不同阶段分离肺成纤维细胞（lung fibroblast,LFb），应用免疫细胞化学和逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）对MMP2和MMP9蛋白及其mRNA进行探讨如下. 1材料和方法 1．1材料 健康雄性SD大鼠，体质量（180±40）g，由华北煤炭医学院医学实验动物中心提供. SiO2粉尘（ 中国 预防医学 科学 院劳卫所）；小鼠抗波形蛋白（vimentin） mAb及免疫组化染色SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；羊抗MMP2和羊抗MMP9多克隆抗体（Santa Cruz产品）；免疫组化SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；Trizol试剂盒（Gibco公司产品）；逆转录反应试剂盒（Takara公司产品）；PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（Sangon公司）；引物由Sangon公司合成，PAGE纯化. MMP2引物序列为5′CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG3′（see），5′CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT3′（antisee），扩增片段长度为303 bp. MMP9引物序列为5′AAA TGT GGG TGT ACA CAG GC3′ （see），5′TTC ACC CGG TTG TGG AAA CT3′（antisee），扩增片段长度为303 bp. 内参照采用GAPDH，引物序列为5′CTT CTG AGT GGC AGT GAT GG3′ （see），5′TGG CAC AGT CAA GGC TGA GA3′（antisee），扩增片段长度为389 bp. 1．2方法 大鼠50只，随机等分为实验组和对照组. 实验组大鼠乙醚麻醉后，采用经气管染SiO2粉尘法复制矽肺模型［2］. SiO2粉尘悬液50 g/L，生理盐水配制，每只大鼠1 mL. 对照组在相同条件下气管内注入生理盐水1 mL. 染尘后1，3，7，14，28 d分别处死实验组和对照组各5只，无菌操作取肺. 采用酶消化法结合组织块贴壁培养法分离和培养细胞. 用SABC法检测细胞的波形蛋白（vimentin）的表达，以鉴定分离培养的细胞为肺间质成纤维细胞. 1．2．1免疫细胞化学检测MMP2和MMP9将第4代LFb接种于载玻片上，贴壁后，血清饥饿使其同步化，按照SP试剂盒说明，作细胞爬片的免疫细胞化学染色. 羊抗鼠MMP2一抗和羊抗鼠MMP9一抗1∶150稀释. DAB显色. PBS代替一抗作阴性对照. 染色结果经Motic Med 数码医学图像分析系统（北航）作图像分析，胞质中的棕褐色颗粒为表达阳性，表达强度用积分吸光度（A）表示. 1．2．2RTPCR检测MMP2和MMP9 mRNA按照Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA. 逆转录步骤参照说明书进行，反应条件42℃ 15 min，95℃ 2 min；PCR扩增反应步骤参照说明书，反应条件94℃，45 s；58℃，45 s；72℃，80 s；30个循环. 扩增产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳. 电泳条带采用凝胶成像系统做积分吸光度（A值）测定，以实验组和对照组MMP2, MMP9与GAPDH的A比值的表示MMP2 mRNA的相对表达量. 统计学处理： 数据以x±s表示，用SPSS 统计软件包进行组间t检验，方差不齐时用t′检验. 2结果 2．1MMP2和MMP9的表达矽肺模型组大鼠LFb MMP2和MMP9表达比对照组明显增强，7 d为表达高峰(Tab 1, Fig 1).表1肺间质成纤维细胞MMP2, MMP