生物药物分析与检测高效液相色谱法.pptxVIP

会计学;2021/8/8;;2021/8/8;2021/8/8;2021/8/8;2021/8/8;2021/8/8;高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高压技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分离分析方法。;概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1-5cm, 长50-500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150-200?m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 ?m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。;HPLC与经典LC区别;经典LC;HPLC与GC差别;2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性;HPLC的特点和应用; 建立高效液相色谱分析方法;;; 由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制，因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速发展，高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现已成为化学化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一。;2021/8/8;2021/8/8;2021/8/8;2021/8/8;2021/8/8;2021/8/8;储液瓶;2021/8/8;HPLC系统;一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2 ?m，可防止颗粒物进行泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。;要求： 输出压力高； 平稳、脉冲小； 流量稳定可调； 耐腐蚀。;4.梯度淋洗装置; 在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。;两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器，混合后进入色谱柱。;通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。;分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。;2. 高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。;仪器：手动进样器-六通阀/定量环;仪器：自动进样器;色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架;内径：1～6 mm，柱长：5～50 cm； 柱填料粒径：5 ～10μm ;（二） 色谱柱 由柱管与固定相组成，柱管多用不锈钢制成，管内壁要求具有很高的光洁度。固定相采用匀浆法高压（80 ～ 100MPa）装柱。 色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类 分析型柱 常量柱：内径2～4.6mm，柱长10～ 25cm。 半微量柱：内径1～ 1.5mm，柱长10～ 20cm 实验室制备型柱：内径20～ 40mm，柱长10～30cm ;色谱柱柱效的评价 柱性能指标包括在一定条件下（试样、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度H和理论塔板数n、对称因子f、容量因子k和选择性因子的重复性α或分离度R。 分析样品时，需检验柱性能是否合乎要求。 ;常用色谱柱柱效评价条件如下： 硅胶柱 样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）； 流动相：无水己烷。 反相色谱柱 （ODS柱等）样品：尿嘧啶（测死时间用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）； 流动相：甲醇——水（85：15） 乙腈——水（60