外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用医学.docVIP

外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用医学 1 1材料和方法 2 文2：外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转 7 1材料和方法 7 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用医学 文1：外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用医学 大量证据表明，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞（epithelialmyofibroblast tradifferentiation, EMT）是肾间质纤维化发生机制之一［1］. 结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是近年来发现与肾纤维化密切相关的细胞因子. 在新月体肾小球肾炎，IgA肾病，局灶性节段性肾小球硬化以及糖尿病肾病的肾活检标本中发现CTGF表达增高，多种肾纤维化动物模型也证实存在CTGF表达上调［2］. 目前较多研究证实，CTGF作为转化生长因子β（TGFβ）的主要下游因子，参与了EMT的发生与 发展 ，但有关CTGF对肾小管上皮细胞直接作用的机制仍不十分明确. 本研究我们探讨外源性CTGF能否诱导人肾小管上皮细胞发生转分化及对细胞外基质合成的作用. 1材料和方法 材料 细胞： 正常人肾小管上皮细胞（HK2）购自 中国 武汉典型培养物保藏中心. 主要试剂：重组人CTGF蛋白（rhCTGF, peprotech），DMEM/F12培养基，HEPES(Gibcol),胎牛血清（杭州四季青公司）；RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），逆转录试剂盒（promega）,Taq酶，DNA maker(TaKaRa ),羊抗人胶原ⅠαpAb（1∶200，Santa Cruz）,小鼠抗人FN mAb（1∶200，NeoMarke），HRP标记兔抗羊二抗，HRP标记兔抗小鼠二抗，（1∶200），DAB显色液（武汉博士德公司）；MTT（美国Sigma公司）；图像分析处理系统（美国UVP公司）；聚合酶链反应引物：均由Invitrogen公司合成 (表1). 表1引物序列（略） 方法 细胞培养及分组将HK2细胞用含100 mL/L FBS的DMEM/F12培养液传代培养，培养条件为37℃，50 mL/L CO2 . g/L胰酶＋ g/L EDTA消化细胞后，1×108/L细胞接种于50 mL塑料培养瓶. 先以100 mL/L FBSDMEM/F12培养细胞，70%～80％融合时改用无血清培养基培养24 h，使细胞生长同步化. 弃去培养液，将HK2细胞分为三组. 对照组：加无血清DMEM/F12培养液；小剂量CTGF组：在无血清DMEM/F12培养液中加入CTGF（终浓度为 μg/L）；大剂量CTGF组：在无血清DMEM/F12培养液中加入CTGF（终浓度为20 μg/L）. 每组设3个复瓶，作用48 h后收集细胞. 细胞形态学观察加入各组试剂后，每6 h在倒置显微镜下观察细胞形态变化，48 h后倒置显微镜下照相. 法将HK2细胞制成悬液，按1×108/L接种于96孔板中，细胞分组同前，每组设6个复孔，刺激48 h后MTT比色法测定细胞增殖，以每孔A490 nm处吸光度（A）值表示. 加入CTGF 48 h后，按照TRIzol说明书在培养瓶中提取总的RNA，经紫外分光光度计鉴定，取总RNA2 μg作逆转录，试验步骤参照逆转录试剂盒说明书进行. 取1 μL逆转录产物为模板，进行PCR扩增反应. GAPDH 反应参数如下：预变性94℃ 5 min,变性94℃ 30 s，退火54℃. E钙黏蛋白（Ecadherin）和纤连蛋白（fibronectin，FN）退火59℃，αSMA和胶原Ⅰα退火63℃, 40 s，延伸72℃ 30 s，28个循环（Ecadherin，FN，αSMA和胶原Ⅰα 32个循环）后，72℃延伸7 min. 取PCR产物5 μL在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统成像后，用图像分析处理系统进行灰度扫描，以密度代表其表达量. 用GAPDH量校正， 计算 出Ecadherin，αSMA，FN和胶原Ⅰα的相对表达量［3］. 重复3次独立的RTPCR全过程. 免疫组织化学细胞爬片制作： 将HK2细胞制成悬液，按1×108/L接种于置有波片的6孔板中，培养条件、细胞分组和处理方法同前，48 h后收集波片. 免疫组化染色：波片冰丙酮固定, Trito