结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达.docVIP

结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达 1 1材料和方法 2 文2：CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 7 1 材料与方法 8 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 14 正文 结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达 文1：结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒的构建与表达 0引言 卡介苗（bacille calmetteguerin, BCG）是已被广泛应用于预防结核病（tuberculosis, TB）的减毒活疫苗. 由于结核DNA疫苗的制备简便、免疫效果好，目前已经成为TB的热门侯选疫苗之一［1］. 结核杆菌热休克蛋白65KD基因（heat shock protein 65KD, Hsp65）是研究最早的结核抗原之一，可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应［2］.粒细胞吞噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimulating factor, GMCSF)作为良好的基因佐剂,可以利用其上调机体免疫水平的作用增强DNA疫苗的效能［3-4］. 虽然Hsp65抗原和GMCSF分别在感染免疫中的作用已经被研究证实有效，但对人GMCSF协同Hsp65抗原在结核杆菌感染中的免疫应答特点和保护力尚不清楚［5］. 我们将两者同时克隆到同一载体上，构建含结核杆菌Hsp65和基因佐剂hGMCSF的双顺反子真核质粒，旨在为进一步了解结核DNA疫苗的免疫效果奠定基础. 1材料和方法 材料 结核分枝杆菌H37Rv株基因组，大肠杆菌DH5α，载体pIRES和质粒pORFhGMCSF(暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室提供)；Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶Nhe I，EcoR I, Xba I和Not I，DL1 kb marker，质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收纯化试剂盒(大连宝生物公司)；两对PCR引物、重组质粒上目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成； Tramaster转染试剂（广州博理生物科技公司）；即用型免疫组化Biotin SPHRP试剂盒，DAB酶底物显色试剂盒（北京鼎国生物科技公司）；鼠抗人Hsp65蛋白单克隆抗体和人hGMCSF蛋白ELISA检测试剂盒（深圳市晶美生物科技公司） 方法 目的基因 Hsp65和hGMCSF的PCR扩增参照GenBank上结核分枝杆菌H37Rv株Hsp65基因CDS序列（NCBI登陆号：M15467）分别设计引物进行PCR扩增. 真核载体的构建与鉴定 将Hsp65的PCR产物经过回收纯化后与载体pIRES，同时用Nhe I和EcoR I双酶切，酶切后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h.转化用低温CaCl2制备的 DH5α感受态细菌，然后涂布于含氨苄青霉素50 μg/mL的LB固体培养基中.次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下150 min振荡培养过夜.先取少量菌液煮沸作为模板进行菌落PCR检测是否有Hsp65的存在，将菌落PCR筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA.将提取的质粒DNA用Nhe I和EcoR I双酶切，进行电泳检测，以DL1 kb marker为分子量参照， 将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定. 测序采用Sanger双脱氧链终止法， 对插入序列的两端进行测定， 测序工作由上海生物工程公司完成. 真核表达 质粒的构建与鉴定同构建pIHsp65载体方法一样，将hGMCSF的PCR产物经过回收纯化后与载体pIHsp65同时用Xba I 和Not I 双酶切，酶切产物经凝胶回收纯化后，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h,然后转化感受态细菌 DH5α，涂布于含氨苄青霉素50 μg/mL的LB固体培养基中.次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下150 min振荡培养过夜.将菌落PCR筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA.将提取的质粒DNA用Xba I 和Not I双酶切，进行电泳检测，以DL1 kb marker为分子量参照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定. 细胞转染 取对数生长期的HepG2细胞接种在12孔板内，