纤维素酶活力的测定.docVIP

PAGE 3 生物化学实验报告 题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法） 姓名： 学号： 班级： 时间： 实验目的： 掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。 实验原理： 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 实验试剂： 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制） 实验器材： 比色管10支。 722型分光光度计。 滴管。 水浴锅。 移液枪。 电炉。 实验步骤： 标准曲线的绘制：分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml的葡萄糖于5支比色管中，均用蒸馏水稀释至1ml，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3ml，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馏水21ml，摇匀。以1ml蒸馏水代替糖作空白管，在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微g数为横坐标，绘出标准曲线。 空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。 样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml，于50度水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm测OD值。 实验结果： 在上述条件下，1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成葡萄糖微克数定为一个活力单位。 纤维素酶活力单位＝ eq \f(N×OD值对应的葡萄糖量,30×1) N酶液的稀释倍数 30糖化所用时间 1反应酶液ml数 实验测得的数据记录如下： 表1 各比色管550nm OD值 比色管 1 2 3 4 5 6 空白 样品1 样品2 样品3 标准葡糖液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -- -- -- -- 葡萄糖/μg 0 200 400 600 800 1000 0 未知 未知 未知 550nm OD值 0 0.109 0.228 0.351 0.487 0.594 0 0.433 0.431 0.431 样品550nm OD值平均值= eq \f(0.433+0.431+0.431,3) = 0.432。 作出标准曲线： 图1 葡萄糖溶液550nm OD值标准曲线 通过标准曲线可求得样品中葡萄糖量为732μg，所以： 纤维素酶活力单位＝ eq \f(100×732,30×1) =2.44×103u/mg 所以每克固体酶的活力=2.44×103×103=2.44×106u 注意事项： 在测定OD值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖浓度为0）调零，测定样品OD值时要用样品空白液调零。从实验原理上看，这样做的目的是：无论是标准液还是样品液，都要去除葡萄糖外的其他各种成分的对OD值的影响。得到的标准曲线经过坐标原点。 用移液管或移液枪加各试剂时，不能将移液管或移液枪头混用。