生物技术制药4抗体工程.pptx

第四节 基因工程抗体(Genetic engineering antibody);;一、单克隆抗体人源化(humanized antibody);（1）嵌合抗体(chimeric antibody);可变区基因的获得;Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL;;现临床应用的嵌合抗体;MabThera for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas;Simulect；（basiliximab 舒莱，巴利西单抗，诺华)：嵌合性人/鼠抗IL-2受体(CD25)单克隆抗体, Remicade：（infliximab,英利昔单抗,抗TNFa的单克隆抗体），治疗炎性肠症(Crohn氏病),类风湿性关节炎 Herceptin(贺赛汀):针对HER-2/neu原癌基因产物的人/鼠嵌合单抗，特异地作用于HER-2受体过度表达的乳腺癌细胞 ;（2）改型抗体（人源化抗体） ;;Humanizing Antibodies;;经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，到现在已有数百种人源化抗体。 人源性可达90%以上 现在以及未来几年，人源化抗体药物将占有主体地位。 目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法;问题;已上市人源化改型抗体;（4－3）小分子抗体;;; 由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。;;;;; Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6;１） Fv;;;方法：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。 Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。 在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。;; 单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法; 在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中; 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。;;;;; 单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式: 一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%; 二是分泌型表达，将细菌的信号肽序???与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。;;单链抗体保留了原有单价Fab的抗原结合能力。由于分子量比较小(25 kD)，有利于穿过血管组织定位于肿瘤。 尽管scFv能满足大部分Fv的稳定性，有时scFv单价结合位点结构干扰了其与抗原的结合，Linker结构会破坏scFc的正确重叠。 在scFv基础上改进：两个scFv联在一起组成双scFv片段(disulfide stabilize Fvs，dsFvs)、permutated Fvs (pFvs)。引入亮氨酸拉链、半胱氨酸及α-螺旋等结构，可用于构建双价单链抗体分子(dsFv)。dsFv在37℃很稳定，具有很强的选择性杀伤细胞毒活性; 适用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 主要应用 １.放射免疫疗法 ２.免疫毒素治疗 ３.体内解毒作用; 即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。 ;分别由单域VH或VL采用基因工程法构建的抗体组成。 在抗原结合部位中，VH作用比VL大，故一般用单域VH抗体。 由于VH暴露了原先与VL结合的疏水性，使其特异性降低，还需对VH片断做一些结构改造才能应用;抗体及其片段分子的特性;小分子抗体;三 多功能抗体; 所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。;双特异性抗体：将两个抗体的重链和轻链V区基因的重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链连接物连接两种不同特异性抗体的可变区基因，构建单肽双特异性抗体。 如：将抗肿瘤细胞EGFR的Fab与抗T细胞CD3的Fab组成双特异性抗体，有助于介导T细胞杀肿瘤（连接效-靶细胞）。 此外还可作为载体将毒素、核酸、药物、定位于靶细胞，发挥治疗肿瘤