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冷冻干燥和液氮保藏菌种技术 冷冻干燥菌种的转接技术 建议用下列方法恢复培养冷冻干燥保藏的菌种。 －、安瓶管开封 1 ．用浸过 70 ％酒精的脱脂棉擦净安瓿管。 2 ．用火焰将安瓿管顶端加热。 3 ．滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂。 4 ．用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。 二、菌株恢复培养 1 ．用无菌吸管，吸取 0.3 ～0.5ml 适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌 体溶解呈悬浮状。 2 ．取 0.1 ～0.2ml 菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面／平板培养基上，剩余的菌液，注入 适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。 3 ．若未能活化，或活化后有疑问时，请于收到菌种 1 个月内，通知保藏中心，经查证无误后， 即免费补寄。 三、注意事项 1 ．菌种活化前，请将安瓿管保存在 6 一 10 ℃的环境下。 2 ．厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状 态。 3 ．某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长，此时请 将步骤二 (2) 重复一次。 液氮超低温保藏程序 1 、容器的选择：使用带螺旋盖的 2ml 塑料安培瓶。 2 、检查安培瓶是否渗漏：用 0.05% 的亚甲基蓝水溶液在 4 ℃浸泡 30-45 分钟，冲洗干净， 弃去含有蓝色染料的安培瓶，其余的安培瓶备用。 3 、打印标签（激光打印）。 4 、容器的灭菌：先用蒸馏水漂洗干净安培瓶，再用蒸馏水在灭菌锅中 121 ℃浸泡灭菌 15 分 钟，干燥并将打印好的标签放入安培瓶中，略拧紧螺旋盖，再行 121 ℃灭菌 30 分钟。 5 、保藏菌菌龄：处于最大生长量阶段或对数生长期后期。 6 、保护剂：选用 5-10% 的甘油或二甲基亚砜作保护剂。 1 ）甘油的准备：在 121 ℃灭菌 15 分钟， 2-8 ℃贮存。甘油一般以两倍最终所需浓度的水溶液 保存，然后与同等量的细胞悬液混合。若不用细胞悬液，则以最终所需浓度的水溶液保存。 2 ）二甲基亚砜：用 0.22um 的聚四氟乙烯过滤膜过滤除菌。过滤膜预先用甲醇和二甲基亚砜 漂洗。无菌的二甲基亚砜以 10-15ml 装量 2-8 ℃避光保存。 7 、分装：在无菌条件下，将细胞悬液（从平板上打下直径为 5cm 的菌块）分装于安培瓶中， 并注入保护剂，拧紧螺旋盖。 8 、将安培瓶固定在铝夹上，贴好标签。为了便于取用，一般一个铝夹上仅放一个菌株。 9 、将控温系统先预冷到 4 ℃，再将铝夹放入其中。以每分钟 1 ℃降温至 -40 ℃，然后以每分钟 10 ℃降温至 -90 ℃。降温以后，将铝夹转移至处于液氮中的储存器中保存。 10 、菌种的复活： 将液氮保藏的菌种取出， 迅速放入 37 ℃水浴中解冻。 一般需 2 至 2.5 分钟 , 等完全解冻后，再及时转接到合适的培养基中培养。