园艺植物基因的分离与克隆.pptVIP

第六十一页，共101页 Differential Hybridization cDNA library low density (~1,000/150mm) Replica plaque lifting mRNA (sample A) mRNA (sample B) labeled probe labeled probe hybridization 第六十二页，共101页 优缺点 优点 在基因序列未知的情况下，直接用来鉴定和克隆差异表达基因，具有简便、快速、RNA用量少、效率高等优点。 主要用于比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的mRNA样品间基因表达的差异。 缺点 假阳性特别高，可达70%，增加了后续工作的难度。 由于PCR 的敏感性，mRNA 差异显示技术重复性较差。 扩增片段较小(110～500 bp)，不能代表差异表达的基因。 只能扩增靠近Poly（A）mRNA 3’端不大于600 bp 的区域。 对高拷贝mRNA有较强的倾向性，不能用于低拷贝的mRNA。 第六十三页，共101页 二、抑制性消减杂交技术 原理 以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交。 所谓抑制PCR是利用非目标基因片段两端的长方向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。 第六十四页，共101页 基本步骤 提取含有目的基因的待测组织(tester