基因工程生化产品制备原理及方法.pptVIP

4、载体的制备与连接 表达载体除了具有一般克隆载体的特性外，还需有强的启动子、增强子、终止子及翻译调控序列如SD序列等 表达载体的构建或选择由所用宿主类型和表达战略两因素决定 不同的宿主有不同的表达载体；大肠杆菌表达系统可采用直接表达、融合表达和分泌型表达三种不同战略 非融合表达载体：pBV220；pET系统；分泌型表达载体等 第二十三页，共50页 （共有24种核酸内切限制酶对pBR322 DNA分子只具有单一识别位点。其中有9种限制酶其识别位点位于四环素抗性基因区，还有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活→因DNA插入而导致基因失活的现象称为插入失活效应。） 具有较小的分子量 (4361bp) 具有两种抗菌素抗性基因 可供作转化子的选择记号 （每个细胞中可累积1000～3000个拷贝） 具较高的拷贝数 第二十四页，共50页 5、目的基因与载体连接 根据目的基因和载体制备过程中产生的末端性质不同，可采用黏性末端连接、平头末端连接和人工接头连接三种不同的连接策略 6、转化：细胞在一定生理状态即感受态（competence）时，可摄取外源遗传物质，摄入的遗传物质可独立复制或在体内重组成为宿主细胞染色体的一部分，并带给宿主细胞某些新的遗传形状→不同宿主需用不同的方法处理 方法 氯化钙转化法 原生质体-PEG转化