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核酸序列的测定 第九十五页，共171页 一. DNA的核苷酸序列分析 1. 种类 1) 酶法 i. 加减法 ss单-DNA→与引物退火→加入4种dNTP和DNA聚合酶→分离纯化ds-DNA→加减法定序系统测序。 加法系统：ds-DNA 4份，每份中加入一种脱氧核苷酸和DNA聚合酶。 减法系统；ds-DNA 4份，每份加入三种脱氧核苷酸和DNA聚合酶。 该法操作复杂，读序较难，但其前半部反应可在其他定序方法中用于序列延伸。 第九十六页，共171页 ii. 双脱氧核苷酸链终止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’ 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。 第九十七页，共171页 第九十八页，共171页 过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。`