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T4 DNA连接酶 用途： 1）互补粘性末端的连接; 2）平头末端的相连； 3）一条带有切口的双链DNA分子； 4） DNA杂合体中ＲＮＡ链上的切口。 E.coli DNA连接酶 用途： 1) 互补粘性末端的连接; 2) 一条带有切口的双链DNA分子。 第三十一页，共75页 （1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP复合物，同时释放出PPi或NMN； （3）连接机理 （2）激活的AMP结合在DNA链5’端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键； （3）与相邻DNA链3’羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMP。 第三十二页，共75页 （4）不同末端连接策略 ①单酶切产生的相同黏性末端 第三十三页，共75页 ②双酶切产生的黏性末端 第三十四页，共75页 ③双酶切产生不同的5?突出末端 第三十五页，共75页 ④双酶切产生不同的3?突出末端 第三十六页，共75页 ⑤双酶切产生的5?突出末端和3?突出末端 第三十七页，共75页 ⑥平切产生的平末端 第三十八页，共75页 平末端DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10%