单克隆抗体制备方法.pptx

单克隆抗体 Monoclonal Antibody; 单克隆抗体(McAb) ;单抗的特点 高度均质性-------始于一个B细胞的单克隆系,均质 高度特异性-------针对单个抗原决定簇反应,一般无交叉反应 来源稳定,产量大 ;①探讨蛋白质的精细结构； ②淋巴细胞亚群的表面新抗原分析； ③组织相容性抗原； ④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析； ⑤肿瘤的定位和分类； ⑥纯化微生物和寄生虫抗原； ⑦免疫-化学疗法（“导弹”疗法， 利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部 位）。可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机 制的研究。;杂交瘤细胞产生 单克隆抗体示意图;性 质;主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； （4）细胞融合； （5）杂交瘤细胞的选择培养； （6）杂交瘤细胞的筛选； （7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定； （9）单克隆抗体的大量制备。;一 、抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好 1 细胞抗原-----可取1×107个细胞作腹腔免疫 2 可溶性抗原-----需加完全福氏佐剂并经充分乳化 3 聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原-------可将抗原所在的电泳条带 切下， 研磨后直接用以动物免疫。 　　选择BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。同时免疫3～4只小鼠。 　　免疫过程因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。共计三到四次。分离脾细胞融合前3～4天加强免疫一次。 ;二 、 三种细胞 1 Sp2/0(骨髓瘤细胞) 　　 本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。融合细 胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。 2 饲养细胞 　　在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入饲养细胞（feedercell）。常用的为小鼠的腹腔细胞。 　　在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。;小鼠腹腔巨噬细胞的制备 　　　　拉颈处死　浸???于75％酒精，消毒3～5分钟 　　　　　　↓ 　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 　　　　　　↓ 　　用无菌注射器注入6～8ml培养液 　　　　　　↓ 　　反复冲洗，吸出冲洗液 　　　　　　↓ 　　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟 　　　　　　↓ 用20％小牛血清(NCS) 的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml 　　　　　　↓ 　　　　　加入96孔板，100μl／孔 　　　　　　↓ 　　　　　放入37℃　孵箱培养 　　;3 免疫脾细胞 　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液， 　　脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。;、细胞融合 　分别收集　洗涤和并计数将两种细胞混合后加PEG(聚乙二醇) 使细胞彼此融合。其后培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。 注意问题 ①细胞比例：常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。 ②反应时间：轻柔操作。在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加１ml培养液；第2min滴加４ml培养液，尔后３min加培养液２0ml。 ③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。;四、HAT选择杂交瘤 　　选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 　　只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 ;五、杂交瘤细胞的克隆化;;七、单克隆抗体的大量生产 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。 　　腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。;八:细胞的冻