异位子宫内膜细胞中整合素α5的表达及其性激素调控临床医学.docVIP

异位子宫内膜细胞中整合素α5的表达及其性激素调控临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：异位子宫内膜细胞中整合素α5的表达及其性激素调控临床医学 1 1 对象与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 4 文2：衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达临床医学 6 1 材料和方法 8 2 结果 11 3 讨论 12 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 15 文章致谢（模板） 16 正文 异位子宫内膜细胞中整合素α5的表达及其性激素调控临床医学 文1：异位子宫内膜细胞中整合素α5的表达及其性激素调控临床医学 子宫内膜异位症（endometriosis，EM）的发病机制尚未完全阐明，研究证据较多的仍为子宫内膜种植学说，同时EM也是一种性激素依赖性疾病。研究表明，整合素分子在EM的发生、发展中起着重要作用。为探讨整合素α5 在EM发病中的作用，作者进行了异位子宫内膜细胞的原代培养并予药物干预，用逆转录.聚合酶链反应（）技术检测各细胞组中整合素α5 mRNA的表达，了解整合素α5 在EM异位内膜中的表达情况及性激素对其的调控作用。 1 对象与方法 研究对象 2003年9月至2004年4月间在东南大学附属中大 医院 妇产科和南京市鼓楼医院妇产科，因卵巢子宫内膜异位囊肿行腹腔镜手术或剖腹手术的患者18例，年龄23～42岁，平均（±）岁，术前3个月内均未用EM治疗药物或激素类药物，术后病理组织学检查均证实为卵巢EM。手术均在排卵前进行。 方法 标本收集处理 手术剥除卵巢囊肿后，在无菌条件下取新鲜囊肿囊壁组织，大小约4cm×4cm，将所取标本置入4℃、无菌、含青霉素及链霉素的 液的取样瓶中，立即送回实验室进行培养。 原代细胞培养 参考 文献 ［1，2］方法进行异位子宫内膜细胞体外培养。培养液为含10%胎牛血清的1∶ ，置于37℃、体积分数为的CO2 培养箱内培养，每2～3d换液1次。于光镜下观察原代细胞形态及生长情况。 细胞传代培养及分组 原代细胞全部或大部分融合后用%胰蛋白酶消化传代，3d细胞开始融合时分为5组。（1）对照组:即非药物干预组，单纯 培养液培养;（2）雌二醇（E2 ）组:含10nmol#12539;L-1 17β.E2 的 培养液培养;（3）安宫黄体酮（P）组:含100nmol#12539;L-1 P的 培养液培养;（4）米非司酮（RU486）组:含1000nmol#12539;L-1 RU486的 培养液培养;（5）三苯氧胺（TAM）组:含1000nmol#12539;L-1 TAM的 培养液培养。继续培养6～7d，至细胞基本长满瓶底时开始收获。 异位内膜细胞中整合素α5 表达的检测 （1）各细胞组中总RNA的提取及鉴定:总RNA提取试剂Trizol购自美国Gibco公司，严格按说明书操作。测定260nm和280nm波长处的吸光度（A），A260 .A280 值在～范围内。（2）引物设计及内参建立:引物序列参考文献［3，4］，经对人类基因库扫描未发现其它同源序列。整合素α5 及内参β2 .微球蛋白（β2 .MG）引物由上海捷倍思生物工程公司合成。整合素α5 序列:5′.′，5′.TGGAGGCTT ′，碱基对长320bp;β2 .MG序列:5′.′，5′.CTTCAACCTCCA ′，碱基对长120bp。（3）条件:采用两步法，RNA酶抑制剂、单克隆鼠白血病病毒逆转录酶（）及Taq酶均购自上海生工生物工程公司。先行RT，反应体系25μl，PCR仪上42℃转录60min，95℃5min灭活，立即冰浴冷却。PCR反应体系50μl，反应条件参考文献［3，4］并加以改进。（4）PCR产物测定:PCR产物进行%琼脂糖凝胶电泳，80V40min，凝胶扫描图像分析系统摄像并分析各目的条带灰度值（OD1 ）。以β2 .MG灰度值（OD2 ）为对照， 计算 PCR产物相对量，用OD1 .OD2 值代表整合素α5 mRNA的表达水平。 统计学处理 实验结果均以ˉx±s表示，应用统计软件包进行单因素方差分析，P表示有显著性差异。 2 结 果 体外培养的异位内膜细胞的形态特点 原代培养的子宫异位内膜细胞在倒置显微镜下观察，腺上皮细胞呈插入性生长，细胞为星形、多角形。接种3d后，细胞呈旋涡状紧密排列，成团生长，胞质呈颗粒状，核圆而大，核仁明显;间质细胞则呈伸展、挺直状，核圆居中。 异位内膜细胞各组整合素α5 mRNA表达水平各组反应物均有相应的扩增带:整合素α5 320bp，β2 .MG120bp（图1）。各组OD1 .OD2 值见表1，各药物干预组与对照组比较均具有显著差异（均为P），但E2 组与P组间、RU486组与TA