胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离培养与鉴定临床医学.docVIP

胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离培养与鉴定临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离培养与鉴定临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 3 3 讨论 4 文2：神经干细胞的临床应用 6 1 C的来源 6 2 临床应用 6 8 问题和展望 9 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离培养与鉴定临床医学 文1：胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离培养与鉴定临床医学 神经系统创伤、缺血及退行性疾病的治疗一直是困扰医学界的一个难题。人和哺乳动物体内及胚胎体内神经干细胞(neural stem cells, Cs)的发现, 为解决这一难题点燃了新的希望。目前，众多学者从各种途径探索治疗神经系统疾病的生物材料及治疗方法［12］。Cs是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞。利用它不仅可以探讨神经系统发育的分子机制,也可作为细胞移植治疗中枢神经系统损伤、退行性疾病及脑肿瘤等疾病。胚胎期的Cs 主要位于纹状体、大脑皮质、视网膜以及脊髓等部位［1,3］，目前利用细胞培养技术已经成功地从上述部位分离出多潜能Cs。尽管Cs 是未分化细胞,不同来源的Cs 之间仍有差别。与中脑及脊髓起源的Cs相比,纹状体及皮质Cs 更适合于细胞移植替代那些因脑内疾病受损的神经元［4］。本研究以胚胎大鼠为供体,采用单细胞克隆技术选择性分离探索了大脑额叶皮质Cs的纯化、标记、不同诱导分化方法及鉴定技术,为进一步研究Cs 的生物学特性和Cs移植替代治疗神经系统疾病提供生物材料及方法。 1 材料与方法 11 材料145 d 胎龄的SD大鼠由东南大学动物实验中心提供。DMEM/F12培养基为Invitrogen公司产品，B27辅助培养基、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF） 及表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF) 均为Gibco 公司产品, 兔抗大鼠Map2和兔抗大鼠GFAP 抗体购自美国RD 公司, 其他免疫组化试剂购自北京中山公司。 方法 121 取材与培养 无菌条件下脱颈处死大鼠，在体视显微镜下小心解剖大脑额叶皮质，机械剪碎,015 %胰蛋白酶消化10min,含10 %胎牛血清的完全培养液终止消化5min。滴管反复吹打成单细胞悬液,1000 r#12539;min-1 离心10min。细胞重悬于Cs 培养液, 即DMEM/F12 (1∶1), B27(体积分数为),EGF (20 ng#12539;ml-1)，FGF(20ng#12539;ml-1)。调整细胞浓度为（4－5）×105ml-1。接种到塑料培养瓶,置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养,每3~4d更换培养液1次。待原代克隆形成后再次用机械分离法制作单细胞悬液, 按5×105细胞密度接种于50ml培养瓶中,每隔7～10 d机械分离克隆传代1次，用1ml注射器(带5号针头)用力吹打混匀(同时换培养液)。采用有限稀释法单细胞克隆连续传代。将细胞接种于96 孔板, 选取只有1个细胞的孔连续观察, 将其增殖所形成的单细胞克隆机械分离成单细胞悬液,将所有细胞接种于25ml培养瓶中,待次代克隆长成后连续传代。 122 Cs增殖与分化的标记鉴定 克隆球Nestin鉴定:将经过多次连续传代所形成的克隆细胞球接种于预先置有多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中, 培养液成分为DMEM/F12（1∶1)、B27辅助培养基(1×50)、20ng#12539;ml-1 bFGF和20ng#12539;ml-1 EGF, 培养7d后行免疫荧光细胞化学染色,观察Cs 特异性抗原Nestin的表达情况。克隆球诱导分化细胞的鉴定：将经过多次连续传代所形成的克隆细胞球吹打成单细胞，调整细胞浓度为（4~5）×105ml-1接种到含5mmol#12539;L-1无血清DMEM/F12(含20ng#12539;ml-1 bFGF, 20ng#12539;ml-1 EGF 及B27 辅助培养液)塑料培养瓶培养形成新的神经球。将神经球接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板,加入20%胎牛血清的DMEM培养液贴壁生长。7d后4%多聚甲醛固定分化细胞5min,封闭液(1 %山羊血清蛋白,03% Triton100)封闭30min。加一抗4℃过夜,PBS漂洗3次,每次10min,然后加入FITC荧光素或罗丹明的相应二抗,孵育30min,弃二抗,PBS漂洗3次,每次10min,磷酸甘油封片,荧光显微镜下观察。对照组采用001mol#12539