动物细胞培养基本操作.pdfVIP

实验一 动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织 (或器官 )取出， 模拟动物体内的生理条 件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化 以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点， 一是便于研究各种物理、 化学等外界因素对细胞生长发育和分化 等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构 (如细胞骨架等 ) 、细胞生长及发育等过程的 观察。 因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的 — 种简便易行的实验技术， 同时我们 也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的 — 些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、 遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识， 了解动物细胞培养的基本 操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒， 掌握干热灭菌法、 湿热灭菌法和 滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。 体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。 细胞养不好与清 洗不彻底有很大关系。 清洗后的玻璃器皿， 不仅要求干净透明， 无油迹， 而且不能残留任何 物质。如有毒的化学物质，哪怕残留 0 ．1 个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分 重要， 对不同的物品需采用不同的灭菌方法。 假如选用的方法不对， 即使达到了无菌却使被 灭菌药品丧失了营养价值、 生物学特性或其他使用价值也不行。 以下在每种灭菌步骤中都介 绍其使用范围。 三、实验材料、用品 材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜 ( 直径 25) ：孔径为 0．22 μm，微孔滤膜 ( 直径 90) ：孔径 为 0．22 μm，过滤器 ( 直径 25) 。 药品： 70 ％或 75 ％酒精， 0 ．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液 ( 来苏儿水 ) ，0 ．5％过氧乙酸，乳 酸，37 ％甲醛，高锰酸钾， NaOH，盐酸， 重铬酸钾， 浓硫酸 ( 工业 ) ，DEPC水 [ 体积分数 0 ．1％ 的焦炭酸二乙酯 (diethylpyroearbonate)] 。 仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。 四、实验步骤 ( 一) 清洗 1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡 5 ％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其 他有害物质。 2 ．使用过的玻璃器皿的清洗 (1) 使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。 (2) 用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。 (3) 浸酸性洗液过夜。 (4) 从酸性洗液捞出后自来水冲洗 10．15 次去除残余酸液，蒸馏水涮洗 3 次，倒置烘干。 (5) 包装 ( 牛皮纸或一般纸 ) 。 (6) 高压 (15 磅 20 min) 或干热 (17 0℃2 h) 灭菌。 (7) 贮存备用。 3 ．胶塞的处理 (1) 新胶塞应先用清水清洗之后再用 0．2 ％NaOH煮沸 lO-20 min 。 (2) 自来水清洗 10 次。 (3) 再用 1％稀盐酸浸泡 30 min 。 (4) 自来水清洗 10 次