《发酵工程》发酵工程技术实训.pptVIP

发酵工程技术实训 实训项目二:基因工程菌复壮与保藏 实训项目三:基因工程菌生长曲线测定 实训目的 1. 学习菌种复壮技术。 2. 利用分离纯化技术对衰退的生产用基因工程菌菌种进行复壮并保藏。 项目二 实训原理 工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)含有抗安苄青霉素基因，能在含安苄青霉素的LB培养基中生长。将贮藏的E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)工程菌单细胞悬浮液涂布在含安苄青霉素的LB培养基中，挑出生长出得菌落，测试其生长速度和目的产物表达量，从中选出生长速度快、目的产物表达量高的菌落作为生产菌株。本实训采用平板划线分离法。 通过人为创造的低温、缺氧等条件，将筛选出的优良菌种进行保藏。本实训采用-80℃低温甘油管保藏筛选出得优良菌株。 项目二 实训器材 1. 菌种 工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)，平板纯化前已由保藏的菌种充分活化（液体试管培养物）。 2. 仪器 超净工作台，培养皿，试管，玻璃涂棒，移液管，接种环，酒精灯，天平，水浴锅，封口胶、纱布，1.5mL离心管，移液抢及灭菌枪头。 3. 培养基及试剂 （1）含氨苄青霉素的LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.2，灭菌冷却至50℃时，加氨苄青霉素（Amp）至终浓度100μg/mL。固体培养基时添加15g琼脂粉。(每台面配制150ml) （2）氨苄青霉素溶液（10mg/mL） 称取氨苄青霉素10mg，加入1mL去离子水溶解，用0.22 祄膜过滤放于4℃备用。(老师准备) （3）灭菌无水甘油：甘油灭菌，烘箱干燥，冷却备用。( 全班配制) 项目二 实训步骤 1.菌种纯化复壮 （1）配制氨苄青霉素琼脂平板LB培养基，用接种环蘸取基因工程菌试管培养物划线分离得单菌落。 （2）配制氨苄青霉素试管液体LB培养基，取单菌落接种于试管37℃培养过夜。（注：因为时间关系由实训老师做。） （3）测试菌种目的产物表达量：取平板上单菌落至少3株，接种于含氨苄青霉素LB液体培养基，摇瓶培养至对数期（OD值0.2~0.3）,加IPTG诱导6h,取诱导培养液SDS电泳，选取表达量最高的菌株3株，用于菌种保藏。（因为时间关系此步不做。） 2.菌种保藏 （1）用移液枪取0.8mL培养液(老师已准备好)于1.5mL无菌离心管中，加入200uL灭菌甘油，盖上离心管盖，上下颠匀，封口胶封好管口，离心管上记录菌种名、保藏日期和操作人名。 （2）-80℃保藏。 项目二 实训目的 1.掌握用比浊法测定细菌的生长曲线。 2.掌握分光光度法测定菌体浓度。 实训原理 将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适宜温度下培养，定时取样测定菌体数量，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一般分为延缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个时期，各时期的长短因菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。 比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度（即OD值），用于表示该菌在本实验条件的相对生长量。 实训器材 1. 菌种 工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)。 2. 培养基 含氨苄青霉素的LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.2，加氨苄青霉素（Amp）至终浓度100μg/mL。(每组配制50ml) 3. 设备 250mL三角瓶，摇床，冰箱，分光光度计，超净工作台，移液抢及灭菌枪头。 实训步骤 1. 取 -80℃保存工程菌菌种E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)，快速融化，接种至3mL LB液体培养基中，接种量为10％，37℃，200rpm振荡培养过夜。（注：因时间关系，本步骤由实训老师做。） 2. 取过夜培养物按10%接种量接入50mL含氨苄青霉素 LB培养基中。37℃，200rpm振荡培养。每隔30min无菌条件下取样，以未接种的灭菌LB液体培养基调零，于600nm下测定吸光值。注意：如果吸光值超过分光光度计读数范围时，则用灭菌后未接种LB培养基稀释到范围以内测定，测定值乘以稀释倍数。 3. 填表，并分别以OD值和OD值的对数为纵坐标，以时间为横坐标生长曲线图。 时间（min） 0 30 60 90 120 150 180 210 240 OD600