纤维素酶活力的测定参考资料.pdfVIP

目的 本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。本方法适用于各种固体和液体纤 维素酶制剂。 说明 本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产 品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的 催化活力。 原理 纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何 一种酶能将纤维素彻底水解。1950 年 Reese 提出了 C1-Cx 概念。C1 是一水解因子，作用 于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成 为长链纤维素分子。再由Cx 最终催化形成还原性单糖。而Cx 通常包括：（1）内切葡萄糖 苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG) 。这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链 纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC ）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。（2 ） 外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91 ），又称纤维二糖水解酶 （cellobiohydrolase，简称 CBH ）。这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分 子 。（3 ）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称 BG ），这类酶将纤维二糖（水 杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。 据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper ）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量 纤维素的总体酶活性（FPA ）、C1、Cx、Cb 酶活性。将底物水解后释放还原性糖（以葡萄 糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系, 即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm 的光吸收值查对标准曲线( 以葡萄糖为标准物) 可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 纤维素酶类活性的定义 Ⅰ 1g 酶粉（1ml 酶液）于50℃pH4.8 条件下，每分钟水解1×6cm 的滤纸（FPA ）产生 1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1 个FPA 酶活力单位。 Ⅱ 1g 酶粉（1ml 酶液）于50℃pH4.8 条件下，每分钟水解50mg 的脱脂棉球产生1μg 还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1 个C1 酶活力单位。 Ⅲ 1g 酶粉（1ml 酶液）于50℃pH4.8 条件下，每分钟水解1%CMC 溶液产生1μg还原 糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1 个Cx 酶活力单位。 Ⅳ 1g 酶粉 （1ml 酶液）于50℃pH4.8 条件下，每分钟水解1%水杨素溶液产生1μg还原 糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1 个Cb 酶活力单位。 程序 1. 试剂和仪器 *本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯 1.1 无水醋酸钠 1.2 冰醋酸 1.3 3，5-二硝基水杨酸(DNS) 1.4 无水葡萄糖 1.5 无水酒石酸钾钠 1.6 氢氧化钠 1.7 重蒸苯酚 1.8 无水亚硫酸钠 1.9 叠氮化钠 1.10 Ⅰ定性滤纸 Ⅱ脱脂棉球 Ⅲ 羧甲基纤维素钠 Ⅳ 水杨素 1.11 水浴锅(恒温)50±0.5℃ 1.12 热干燥箱80±1℃ 1.13 722 型分光光度计 1.14 分析天平（感量0.1 ㎎） 1.15 一级玻璃制品 1.16 冰箱 2. 试剂的制备 2.1 0.1M 乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8 ） 溶液A ：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M 醋酸溶液。 溶液B ：称取8.2g 醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M 醋酸钠溶液。 使用是以A ：B=4 ：6 的比例混合，低温冷藏备用。 2 .2 DNS 显色剂: 溶液A:称分析纯的NaoH104g 溶于1300m 水中,加入30g 分析纯3,5－二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500m 水中，再称 25g 重蒸苯酚和25g 无水亚硫 酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A 、B 溶液混合，加入1200m 水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。 2.3 Ⅲ CMC （1%） 准确称 1.000g 羧甲基纤维素钠用pH4.8 醋酸缓冲液溶解并定容至 100m 。 Ⅳ 水杨素（1%） 准确称 0.25g 水杨素用pH4.8 醋酸缓冲液溶解并定容至25m 。 2.4 标准葡萄糖溶液的配制 无水葡萄糖80℃烘