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专题三 分子生物学实验室的基本常用技术 1 核酸的纯化 分离提取的核酸样品， 分为 DNA 和 RNA ，由于不同的实验要求， 需用不同的方法进一步纯化， 核酸纯化的主要目标是去除其中的蛋白、多酚、多糖、盐离子等杂质 。 核酸纯化的方法很多，不同的方法对应于不同的研究目的。超速离心、柱层桥、分子杂交、免 疫沉淀、凝胶电泳等方法将在核酸分离、提取的有关专题中加以介绍。 在此仅介绍从核酸溶液中 去除蛋白质的酚 / 氯仿抽提法 。这个方法的标准程序，是酚 /氯仿 (1:1) 抽提一次，氯仿抽提一至二次，如果情况需要可再重复几次。 1.1 酚/氯仿抽提法的基本原理 混合使用酚、氯仿 这两种不同的 蛋白质变性剂 ，以增加去除蛋白杂质的效果。因为酚虽可有效 地变性蛋白质， 但它不能完全抑制 RNA 酶 (RNase)的活性， 而且酚能溶解 10％-15 ％的水， 从而 能溶解一部分核酸。为了克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于核酸提取，显得更加 重要，同时氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 在氯仿中加入少许 异戊醇 的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生 气泡 。 最后用 氯仿 抽提处理，是为了去除核酸溶液中的 痕量酚 。 如果所提核酸的酶反应条件要求极严格，最可靠的方法是再用水饱和的 乙醚抽提一次，以彻底 去除核酸样品中的 痕量酚与氯仿 ，然后在 68℃水浴中放置 10 分钟，使痕量乙醚蒸发掉。 1.2 酚/氯仿抽提法的基本步骤 如果 DNA 或 RNA 体积较小，一般于 1.5ml 的 Eppendorf 离心管中进行， 若体积较大则于 10-50ml 的离心管中进行。应事先准确测量样品的体积。 1) 在每一样品中加入 等体积的酚 /氯仿 / 异戊醇（ 25:24:1 ）溶液。 2) 若 DNA 片段小于 l0kb ，可以振荡 混合 ；若大于 l0kb ，则反复轻柔地转动离心管， 形成乳状 液。 切勿使用高速的振荡器 。 3) 室温 下，于 10000 ×g 以上（一般要 10000-12000 rpm 以上） 离心 l0 分钟。 4) 吸取上层水相于一个新的离心管中。如果 DNA 的分子量较大，可将枪头的尖端剪去一截， 以增大枪头口的直径。吸取速度要慢而匀，这样既减少吸液时的机械剪切，又可尽量 避免吸取 界面处 的蛋白杂质层。 5) 加入 等体积氯仿 /异戊醇（ 24:1 ）溶液，重复步骤 (2) 、 (3) 、(4) 。 6) 向核酸溶液中加入等体积的水饱和乙醚，混匀，静止 2-5 分钟分层，含核酸样品的水相在下 ( ) 层 乙醚高度挥发、易燃，应在通风厨中工作 。 7) 移弃上层乙醚。 8) 将核酸溶液于 68 ℃水浴 5-10 分钟，不时用手指弹动管壁，使乙醚蒸发。 乙醇沉淀核酸 后述 。 9) ( ) 1.3 酚/氯仿抽提法的注意事项 1) 必须采用 Tris 缓冲液平衡后的重蒸酚， pH 必须在 8.0，中性尤其是酸性酚在核酸沉淀中会 导致 DNA 的沉淀而随杂质一块丢失。 2) 该法 只能去除核酸中的蛋白杂质 ，而多酚、多糖等杂质则很难除去。 3) 如果对 DNA 去蛋白效果要求更高，可以在酚 / 氯仿 /异戊醇抽提后又 重复 一次酚 /氯仿 / 异戊醇 抽提。 4) 如果要求非常彻底地去除产物中的 痕量酚 ，可以在氯仿 / 异戊醇抽提后又重复一次氯仿 /异戊 醇抽提。 5) 常规实验中一般对痕量残存氯仿的去除效果要求不太高，因此