亚硫酸氢钠测序法.docxVIP

亚硫酸氢钠测序法（bisulfite genomic sequencing） 直接测序法是建立在 MS既础上进一步深入研究 CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫 酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嚅嚏脱氨基转变成尿嚅嚏 ，而甲基化的胞嚅嚏保持不变 ，行 PCRT增（引物设计时尽量避免有 CpG,以免受甲基化因素的影响）所需片段，则尿嚅嚏全部转 化成胸腺嚅嚏.最后，对PCFT物进行测序，并且与未经处理的序列比较 ，判断是否CpG^点发 生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法 ，能明确目的片段中每一个 CpG位点的甲 基化状态.在寻找有意义的关键性 CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛 两侧不含 CpG点的一段序列为引物配对区 ，所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列 . 它的不足是耗费时间和耗资过多 ，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据 ，需要大量 的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵. 第一部分基因组DNA勺提取. 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的 DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟， 自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力 ，提出的基因组 DNA应 该是完整的. 此步重点在于 DNA的纯度，即减少或避免 RNA蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用 蛋白酶K及RNA酶以去除两者. 使用两者的细节：