酶的提取与分离纯化（课堂PPT）.pptVIP

第四章 酶的提取与分离纯化 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme;酶的提取与分离纯化定义; 酶的提取、分离纯化技术路线;酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各种 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。;第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）;表4-1 细胞破碎方法及其原理;化学破碎法;一、机械破碎法;一、机械破碎法;一、机械破碎法;二、物理破碎法;1、温度差破碎法;2、压力差破碎法;步骤： 高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂 适用范围： 膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏 ;3、超声波破碎法;超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。 ;超声波破碎法特点： 处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失少、效果好； 是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物细胞的破碎。 超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。;4、反复冻融法;5、干燥法;三、化学破碎法;三、化学破碎法;1、有机溶剂;2、表面活性剂;在酶的提取方面一般不采用离子型表面活性剂的原因： 离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，引起酶的变性失活。 如何除去表面活性剂？ 可采用凝胶层析，以免影响下一步分离纯化。 ; 化学破碎法的优点： A、对产物释放具有一定选择性。 B、细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度 低，易于固液分离和进一步提取。; 化学破碎法的缺点： A、通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。 B、时间长???效率低，一般胞内物质释放率不超过50％。 C、有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中，需设法分离除去。 ;四、酶促破碎法;1、自溶法（Autolysis） ;自溶法的缺点： 易引起所需蛋白质的变性；自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降；易引起杂菌或噬菌体感染。 ;2、外加酶处理 ;破坏微生物细胞壁的酶：溶菌酶 、葡聚糖酶、 几丁质酶等； 破坏植物细胞壁的酶：纤维素酶、半纤维素酶等。;酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。 酶溶法的不足： 1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低； 因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。 2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确定最佳的溶解条件。;机械破碎; 破碎细胞的不同分类方法 ; 破碎细胞的不同分类方法 ;破碎细胞方法： 动植物细胞：高速组织捣碎机 组织匀浆器 微生物细胞：机械破碎法 酶法 化学试剂法 物理破碎法等多种。;第二节 提取（ Extraction ）;第二节 提取（ Extraction ）;酶的主要提取方法;一、提取的方法;;2、酸溶液提取;3、碱溶液提取; 4、有机溶剂提取;其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好。 原因: 丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10％，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中的溶解能力大大增加。;提示： 一些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。 例如，胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0进行提取。;从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：