实验八总氮量的测定——微量凯氏.docxVIP

实验八 总氮量的测定 - —微量凯氏 （Mi cro-K j e Idah 1 ）定氮法 【目的和要求】 1。 学习微量凯氏定氮法的原理 2。 掌握微量凯氏定氮法的操作技术 ,包括标准梳酸铵含氮量的测定、未知样 品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等 【原理】 天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。 当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的 氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢 ,可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸 钠促进之 ,其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂 过氧化氢也能加速反应 . 消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解 ,放出氨。 用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中， 然后用标准碱溶液进行滴定， 准确测定氨量，从而折算出含氮量 . 以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下 : 测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结全， 生成铵离子 ,使溶液 中氢离子浓离降低 .然后再用强酸滴定 ,直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所 用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。 本法适用的范围为0。 2-1。Omg氮。相对误差应小于土 2% 【操作方法】 一、样品处理 血清样品：取人血或猪血（蛋白质样品含水量一般为 10%?12%）,放于 离心管中 ,于冰箱中放置过夜，次日离心除去血凝块，上层黄色透明清液，即为 血清?吸出1 ml血清，加到50m I容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀备用。 溶液如显浑浊,加少量氯化钠,再混匀。 固体样品：测定某一固体样品中的含氮量 ,是按 100克该物质的的干重所含 的氮克数来表示 （%）。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将 样品磨细，在称量瓶中称入一定量的样品，再置于105C的烘箱内烘烤1小时?用坩 埚钳将称量瓶放入干燥器内 ,待降至室温后称重．按上述操作，每烘干 1 小时后 重复称量一次，直至两次称量数值不变 ,即达到恒重为止。 二、消 化 准备4个50ml的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各加入2ml稀释 血清溶液（或 4ml核酸制品溶液，或2 0 0 m g固体粉末）。注意，用吸量管直接将 溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向 3、 4号烧瓶加入 2ml 水,作为空白对照 ,测量试剂中可能含有的微量含氮物质 ,以对样 品进行校正 . 在每个烧瓶中加入约30 0 mg硫酸钾—硫酸铜混合物，再用量筒加入化学 纯浓硫酸3 ml,将以上4个烧瓶放到消化架上（见图4— 1），（如无消化架,可将烧 瓶放在置于通风橱内或通风处的电炉上） 进行消化。接好抽气装置，调节煤气量。 先用小火焰加热煮沸，首先看到烧瓶内物质碳化变黑，并产生大量泡沫 ，此时要 特别注意，不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重地影响样品的测定结果。 当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到使瓶内液体 微微沸腾。假如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇 ，用消化液 体将它冲洗下来，在消化中要时常转动烧瓶，使全部样品都侵泡在硫酸内 ，以便 在微沸的硫酸含中不断消化，消化液在轻度迥流的状况下大约维持 6?8小时（对 于那些赖氨酸含量较高的蛋白质样品甚至需要 1 2小时）。待消化液变成褐色后， 为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将3 0%过氧化氢溶液1?2滴，加到瓶 底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告完 成（固体样品约需7小时）。为了保证反应的彻底完成，再继续加热消化1小时。消 化完结，关闭煤气灯，使烧瓶冷却室温? 三、蒸馏① 1 ?仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤.一般洗涤是先用水洗 净棒状玻塞（见图4 — 2 ）周围，每次实验后要洗去氢氧化钠溶液，以防样品加入 时立即放氨。 图4 样品消化架 图4-2微量凯氏蒸谓装置 1 ?凯氏烧瓶2.抽气 i.煤气灯2■蕪汽发生器3.长玻璃住4.橡皮管 消化架4.煤气 录小玻杯6.棒状玻塞7.反应室反应室外壳 艮夹子10.反应室中播管II.冷凝器12■锥形和 使用前全部蒸馏装置必须用水蒸汽充分洗涤。用水蒸汽洗涤蒸馏器的目的在 于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器（尤其是正在测定中的 仪器），加样前使蒸汽通过1?2 mi n即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用 水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸-指示剂混合液中指示剂颜色合格为止， 洗涤方法 如下: 取2~3个50ml的维形瓶，加入5ml左右2%硼酸-指示剂混合液，用表面 皿覆盖备用。先煮沸蒸汽发生器（见图4-2），器中盛有用几滴硫酸酸化过的蒸馏 水，并加几滴甲基红指示剂蒸馏器中还应放入一些毛细管， 它们的长