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蛋白质层析方法与原理简介第1页/共29页蛋白质蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。第2页/共29页纯化蛋白质的方法 其中层析法是基因工程下游的核心，它是最有效和最重要的蛋白质纯化工具。第3页/共29页色谱法（层析法）第4页/共29页色谱法的分类凝胶过滤 离子交换 疏水相互作用 反相色谱 亲和色谱第5页/共29页凝胶层析（分子筛）第6页/共29页凝胶层析 凝胶是惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和。具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。原理：空间排阻第7页/共29页第8页/共29页第9页/共29页离子交换层析第10页/共29页离子交换层析离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。流动相固定相第11页/共29页离子交换层析平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。如Na+和Cl-。阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用。阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用。流动相阳离子交换剂第12页/共29页离子取代顺序COOH +RNH3Hydrogen gainedLow pHPositive chargeHigh pHNegative charge-COO+RNH3 -Hydrogen lostCOORNH2第13页/共29页pH值对蛋白质所带电荷的影响第14页/共29页阴离子交换分离过程第15页/共29页第16页/共29页离子交换的基本步骤平衡阴离子交换介质--+-++--++-+-----------第17页/共29页离子交换的基本步骤上样和清洗---++++++----------------------------------第18页/共29页离子交换的基本步骤洗脱++++++++++++---+----------------------第19页/共29页离子交换的基本步骤再生+++++第20页/共29页疏水作用层析第21页/共29页疏水作用层析水分子表面暴露的疏水集团 疏水作用层析（HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。 疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。 配基溶质分子流体中的水分子配基DG = DH - T DS第22页/共29页第23页/共29页第24页/共29页亲和层析第25页/共29页亲和层析亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。第26页/共29页第27页/共29页第28页/共29页谢谢