新pfge脉冲场电泳技术培训chef故障排除.pptx

会计学;排除 PFGE 凝胶 故障 比较复杂，涉及到多种因素 : 实验室各自的技巧和技能 实验室环境和设备条件 试剂 水质 实验过程中意外的干扰和分心 ;通过改正一些不好的实验操作 （习惯） 能够帮助解决部分 PFGE 结果不佳的困惑 精准地 称量和 定容（积） 计算精确 确认所有仪器设备处于良好的工作状态 检查试剂化学品不得有沉淀、变色、絮状、过期 采用正牌厂家的试剂耗材 整个实验过程中戴手套 确认玻璃器皿干净， 不得有清洁剂、脏物碎片等残留，因为这些因素可能会影响凝胶小块的制备、裂解， 从而导致结果背景上出现 斑点，脏点 千万不要使用质量差的塑料容器， 除非你确保它能被洗干净 千万不要过分加热琼脂糖溶液 配置酶混合液时要混合充分 处理每种微生物实验时，采用合适的试剂、内切酶和电泳参数条件;想一想，对照上次成功的实验，有哪些因素变化了？ 过程方面： 仪器设备 试剂耗材 人力因素 考虑操作规程中的所有步骤，自检式提问是否故障源自于其中某一个环节？ 考虑和观察凝胶的每片区域，试图识别其中某个区域可能同失败的原因有关联 要做到这些， 操作者必须对每一步骤的的目的很熟悉，以及对每一步错误的操作可能带来的潜在后果明晰;（二） 模糊一片的条带 (Fuzzy or Smeary Bands);分析： 这是很典型的假象 造成原因是 蛋白酶消化 或 核酸内切酶切割 不完全 . 只有小胶块 的外周边缘接触到酶，得到了消化，而中心区域的样品却未被处理到位，所以样品电泳结果象个“盒子” 改进建议： 小胶块做薄点； 降低制作小胶块的琼脂糖浓度 酶处理时间适当延长 采用新鲜酶试剂 增加酶的浓度;（三）歪曲的条带 (Distorted Bands);（三）歪曲的条带 (Distorted Bands);（三）歪曲的条带 Distorted Bands;（三）歪曲的条带 Distorted Bands;（三）歪曲的条带 Distorted Bands;（四） 样品没有往下方向迁移 Samples Not Migrating Down the Gel;（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction;（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction;（四） 样品迁移方向错误---条带倾斜;（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction;Top of gel (wells);（四）样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction;（四）样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction;（四）样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction;(五) 蛋白酶K消化步骤不完全没加Sarcosyl (十二烷基肌氨酸钠）;(五)蛋白酶K消化后没有充分洗胶块以去除碎片杂质 ;问题: 不完全酶切反应会造成条带“重影”或称 “鬼影” ， 可能的原因: 小胶块质量差 – proteinase K 没有清洗去除干净 DNA 浓度过高 内切酶浓度 内切酶商品/ 酶切缓冲液 批次质量问题 内切酶商品/ 酶切缓冲液 过期 酶切孵育时间或温度条件错误;;酶孵育时间过长 (过夜），就出现了 “星晕状---Star Activity ）现象； 同样的酶 （Ascl)反应2小时， 则没有; ;SfiI;Without thiourea;建议: 在凝胶中加上阳性对照 – 用曾经验证过的， 依赖于硫尿帮助分型的菌株 DNA 样品 小胶块. 用了这个阳性对照后， 证明 无法分型的原因同其它，如制胶块，试剂等无关。只是系统中需要硫尿 如果DNA质量不好, DNA 将滞留在孔内，即使加入硫尿也无济于事. 加入 50μM thiourea (i.e. 10mg/ml 母液取873ml) 直接加入到 (0.5X TBE)， 然后电泳. 只在少部分菌株分型中需要，并非常用 Use only when needed (with known strains or suspected serotypes) and not routinely. 小心: 硫尿是变性剂， 使用和丢弃时 格外小心，须按照有毒有害废品管理规范处理;Old culture 48 hrs;（八） 制作包埋菌体的小胶块步骤;Exposure time: Too short = difficulty visualizing faint, bottom ba