质粒目的基因插入及引物设计流程.pptVIP

一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列） 1.选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基； 2. 注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长， 则说明CDS序列稳定可用； 将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该 段序列中的可能酶切位点 二. 登录 找到质粒的全序列 同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点） 1.质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点， 否则目的基因会被切掉； 2. 质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒 选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用： 选中目的基因序列，复制 在AflI后至BamHI 前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1 在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询： 三.克隆引物设计 1. 电脑设计：回到NCBI的primer blast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)， 在框中输入|a|和CDS序列，并在M