Bac-to-Bac_表达系统精简资料.pdfVIP

Bac-to-Bac 表达系统 I. pFastBac-X 重组质粒的构建 利用分子生物学技术构建所需的 pFastBac 重组质粒, 以 DH5α 为宿主,进行扩 增.(以下以pFastBac-X 为例进行说明. II. pFastBac-x 重组质粒的转座步骤： 1. 制备LB 琼脂平板。 LB 培养液（含Agar ）：胰蛋白冻10g/l，Nacl 10g/l ，酵母提取物5g/l ，Agar 15g/l 高压灭菌后，培养基温度下降至60℃左右迅速加入下列成分： 卡那霉素 50ug/ml 庆大霉素 7ug/ml 四环素 10ug/ml Bluo-gal 100ug/ml IPTG 40ug/ml 各成分混匀后，乘热在每块平板中加入约20ml 培养基，待凝固后放置37℃烘箱 干燥产生的水汽。 2. 取出DH10BacTM 感受态细胞冰上融解。 3. 用移液枪吸取100ulDH10BacTM 感受态细胞于1.5ml EP 管。 4. 轻轻加入1ng （约5ul ）重组质粒X 于感受态细胞中，轻轻敲打管壁使之混匀。 5. 冰上放置30min 。 6. 42℃循环水浴静止45 秒。 7. 快速放置冰上2min 。 8. 在上述管中加入900ul S.O.C.培养基。 9. 将EP 管置于37℃摇床（225rpm ）4h 。 10. 用S.O.C.稀释上述细胞至10－1、10－2、10－3 。 11. 在每块LB 培养基中加入上述稀释液100ul，涂布均匀。 12. 37℃培养24 －48h 。（单克隆很小，24h 前很难分辨是否为蓝色克隆） 注：1）1、3、4 、8、10、11 在超净台内进行。 2 ）用X －gal 代替Bluo-gal 会降低颜色浓度。真正的白色克隆在菌落长得较大时 还是呈白色，建议在黑色背景下进行挑选。 III. 重组Bacmid DNA 的分离提取 （在提取前，可以在含Bluo-gal 的LB 琼脂平板上划板进一步确认） 溶液配置：溶液Ⅰ：Tris-Hcl(15Mm) 0.119g EDTA (10Mm) 0.187g Rnase (100ug/ml) 0.5ml(贮备液10mg/ml) 用纯水溶解并定容至50ml （调pH8.0 ） 溶液Ⅱ：NaOH 0.2 SDS 1% 溶液Ⅲ：醋酸钾（3M ） 14.7g 溶解定容至50ml ，pH5.5 TE 溶液： 1. 挑取白色克隆于 2mlLB 培养基（含 50ug/ml 卡那霉素、7ug/ml 庆大霉素、 10ug/ml 四环素），37℃摇床250 －300rpm 培养24h 以上。 2. 取1.5ml 培养物于1.5mlEP 管中，14000×g 离心1min 3. 倒去上清夜，倒立于吸水纸上。然后加入0.3ml 的溶液Ⅰ用枪头轻轻吹打重悬 细胞。 4. 加入0.3ml 溶液Ⅱ，轻轻混匀，室温放置5min （溶液变清） 缓缓加入0.3ml 溶液Ⅲ，轻轻混匀，形成蛋白及DNA 沉淀，冰上放置5 －10min。 5. 14000g 室温离心10min，期间另取一2ml 离心管，加入800ul 异丙醇。 6. 轻轻把上清液转入含异丙醇的离心管，避免把白色沉淀带入。轻轻倒转离心 管数次。冰上放置5min （该过程可放在－20 ℃过夜）。 7. 室温离心15min 8. 去上清，倒置离心管于吸水纸上，然后加入70 ％乙醇洗涤沉淀数次，14000g 室温离心5min 9. 尽可能弃去上清，小心操作，勿使沉淀弃去。 10. 使沉淀在空气中自然挥干，5 －10min。加40ulTE 溶液，轻敲管底，使溶液 位于管底部。只要沉淀没有过分挥干，DNA 在10min 内就可以用了。 注：1）重组Bacmid －X 大于100kb，故在操作过程中应避免机械力剪切，破坏 重组粘粒的完整性。 2 ）将提取的Bacmid －X 溶液分装，避免冻融次数过多而降低转染效率。 IV. 重组Bacmid －X 转染sf9 细胞的操作步骤 5 1. 在六孔板中接种9×10 个细胞/2ml/孔。其中培养基Grace’s medium 中含有青 霉素50U/ml，链霉素50ug/ml，10％FBS 。 2. 27℃培养1h，使细胞贴壁。 3. 在这期间制备Bacmid －X 与Cellfectin Reagent 复合物 a. 用100u