抗体的检测和纯化2讲课文档.pptVIP

　结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。 现在五十四页，总共七十六页。 层析精细纯化技术： 目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、疏水层析等。 现在二十二页，总共七十六页。 CaptoAdhere 目的：使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除去。 原理：Capto Adhere介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine）综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚集体具有非常独特而高效的去除能力；此外，通过有效的实验设计 (Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere 介质还可以同时有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体的两步层析纯化工艺成为现实 步骤：首先，需要优化抗体在Capto Adhere上的结合条件。（确定的主要影响因素和实验设计范围为：电导：2-15mS/cm，每毫升凝胶上样载量为75-300mg/ml (流穿模式)，pH范围需要做起始结合条件确定：通常在低电导条件下 (如2mS/cm时) 样品完全不结合到有少量样品结合的pH条件） 现在二十三页，总共七十六页。 CaptoAdhere 其次（HTPD Predictor）： 确定好实验条件后，可以同时平行做所有不同的结合条件，将试验结果相应于响应因子进行统计学分析 合并分析结果可以得到满足实验目标的操作范围。 结果和优势： 流穿模式的Capto Adhere将宿主蛋白、脱落的蛋白A和聚集体降低到很低的水平，载量可达100-200mg/ml介质，单步收率90%。此外，Capto Adhere还具有很强的病毒去除的能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。 。 现在二十四页，总共七十六页。 将Mabselect SuRe和Capto Adhere相结合进行两步层析纯化。Mabselect SuRe可以达到99%的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯: 使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时 间，提高生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。 两步层析工艺 现在二十五页，总共七十六页。 完善工艺整合中的其它问题 1， 核酸和内毒素的去除。 2， 脱落亲和配基 (蛋白A) 的去除。 a,阴离子交换层析是去除蛋白A-IgG复合物。 b,阳离子交换层析也可以去除蛋白A配基 。 3,抗体制品的病毒去除/灭活及验证。 低pH孵育、加热、S/D (溶剂/去污剂)、纳滤等 现在二十六页，总共七十六页。 1， 核酸和内毒素的去除。 现在二十七页，总共七十六页。 2， 脱落亲和配基 (蛋白A) 的去除。 a,阴离子交换层析是去除蛋白A-IgG复合物。 b,阳离子交换层析也可以去除蛋白A配基 。 3,抗体制品的病毒去除/灭活及验证。 低pH孵育、加热、S/D (溶剂/去污剂)、纳滤等 现在二十八页，总共七十六页。 特异杂质含量验证 DNA含量：DNA分子杂交法测定。（100pg/一剂量） 热原（内毒素）：家兔法等试剂。（5EU/Kg） 病毒含量：Scale-down。（工艺除病毒能力需达到10log以上） 现在二十九页，总共七十六页。 单克隆抗体的浓缩 目的 方法：冻融浓缩法 原理：冻融处理后的样品，其溶质集中在浓缩管的下端，越近管底浓度越高 现在三十页，总共七十六页。 ELISA ------ 徐顺 胡坚 李静一 现在三十一页，总共七十六页。 1.　ELISA的原理 2.　ELISA的类型 3.　试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4.　对照设定 5.　标本的采取和保存 6.　结果判断 现在三十二页，总共七十六页。 ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 是一种免疫测定试验 。 基础: 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性