《生物技术实验》教学大纲（本科）.docxVIP

PAGE PAGE 97 生物技术实验 一、课程简介 生物技术实验是基础医学实验教学的重要组成部分，内容涵盖分子生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、医学免疫学等学科领域中常用的基本操作技术。 通过生物技术实验教学，使口腔医学专业学生掌握了蛋白质分离与含量测定、基因扩增及免疫学相关原理和基本操作技能，本实验教学课程加深学生对相关理论课内容的理解。本课程培养学生科研工作的基本能力、提高学生实验动手能力和分析问题、解决问题的能力。本课程为口腔医学专业学生将来的科学研究奠定基础。 二、实验教学内容 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 基本内容：聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续体系、缓冲液离子成分的不连续性、pH 的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度 1—2mm），然后再进行电泳分离。 基本要求：掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。 葡聚糖凝胶层析分离蛋白质 基本内容：凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部（阻滞作用小）而沿凝胶颗粒间隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部（阻滞作用大），流程长，流速缓慢，最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 基本要求：掌握葡聚糖凝胶层析分离蛋白质的方法，了解核酸—蛋白检测仪及部分收集器的工作原理和使用。 酵母蔗糖酶米氏常数（Km）的测定 基本内容：蔗糖酶在 pH5.0 缓冲液中与不同浓度的蔗糖混合，恒温培养，经过规定时间生成一定数量的还原糖。还原糖在碱性溶液中与硫酸铜共热使二价铜（Cu2+）还原生成氧化亚铜，氧化亚铜再使磷钼酸还原成钼蓝，用分光光度法测定钼蓝，并进而判定还原糖的生成量，以此代表反应开始阶段的初速度（V）然后以不同底物浓度的倒数按林—贝氏作图法，从横轴上截距求出 Km 值。 基本要求：了解底物浓度对反应速度的影响及 Km 值的意义。 Lowry 氏法测定蛋白质含量 基本内容：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物），在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。在 500nm 处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。 基本要求：学习 Lowry 氏法测定蛋白质的原理和方法。 温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 基本内容：本实验是观察在不同温度、pH 以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种因素对酶活性的影响。唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。 基本要求：了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性影响的原理。 6.X 染色质制备与观察 基本内容：正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即 X 染色质。通过采取口腔黏膜细胞作为检查材料，经染色后可进行观察。 基本要求：熟悉 X 染色质标本的制作方法。 PCR 扩增及琼脂糖凝胶电泳 基本内容：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用 DNA 聚合酶依赖于 DNA模板的特性，在体外模拟 DNA 的复制过程，经过变性、复性、延伸三个过程，在一对附加的引物之间诱发聚合反应，短时间内可将要研究的目的 DNA 扩增数百万倍。 基本要求：了解 PCR 技术的原理，掌握 PCR 技术的程序和步骤。 单双扩散 基本内容：用一定浓度的琼脂制成凝胶后，其内部形成一种多孔的网状结构，可允许大分子物质通过。可溶性抗原与抗体在琼脂糖凝胶自由扩散后形成沉淀。 基本要求：掌握抗原抗体定性沉淀反应原理，了解 IgG 等免疫球蛋白的定量检测技术。 对流免疫电泳 基本内容：对流免疫电泳是双向琼脂扩散和电泳技术相结合的实验技术。抗原在碱性缓冲液中带负电，向正极移动；抗体蛋白质较大，负电荷少，借电渗作用缓慢移向负极，在适当的条件下，可形成抗原抗体反应而出现沉淀。 基本要求：掌握抗原抗体在电场中的反应条件；熟悉对流免疫基本技术。 血型测定和免疫妊娠胶体金间接凝集 基本内容：用胶体金标记技术，检测尿中有无 HCG。首先将鼠抗人 HCG 的单克隆抗体（一抗）吸附在胶体金颗粒上（胶体金呈紫红色散在颗粒状，肉眼可见）并松弛地附着在 A 处。鼠抗人 HCG （一抗）及兔抗鼠 Ig（二抗