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精心整理 Snapshot技术平台 SnaPshot 技术平台是Applied Biosystems,ABI 公司推出了专为检测 SNP 设计的 分析软 件和试剂盒可对多个 SNP 位点同时进行基因分型 ,也被称为 minisequencing 。该方 法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot 反应后 ,产物通过电泳分离、五 色荧光检测、Gene mapper 分析 ,可在 一次电泳胶 内检测 多个 SNP 位点。这个平 台是建立在3730，3130 等PCR 测序仪上的技术。 3730XL 型DNA 序列检测仪 一.??? SnaPshot 工作原理 应用 SNaPshot 进行定点的序列分析 ,其基本原理遵循了DNA 直接测序中的 双脱氧终止法 ,所不同的是 PCR 反应中只有不同荧光标记的ddNTP 。由于每个 精心整理 精心整理 SNP 位点的引物 3 ′端都紧靠SNP 点 ,因此每一种引物在聚合酶作用下 ,根据模板 的的序列 ,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统 ,检测延伸的那个核苷酸 的种类。 1．多重SNaPshot 反应的工作原理： 在一个SNaPshot 反应体系中， 针对每个待测 SNP 位点 在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物）， 引物的Tm 值要求在50 度以上 ，在 AmpliTaq 聚合酶和 4 种不同荧光标.记的ddNTP 存在的情况下,各条引物与各自互补的DNA 模板结合, 聚合酶在引物的3’末端延伸 单个碱基反应即告终止, 产物的长度为引物长度+1bp 。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型 ，其中纯 合子表现为单峰，杂合子表现为双峰 。为了能够分辨不同SNP 的不同基因型，可在 引物的5’末端加上不同长度的Poly C 或Poly T，使各条引物以长度区分。经电泳将 其分开。最短的引物一般设定为20bp, 相邻两个SNP 的引物之间长度一般相差 4-6 个核苷酸，以便区分。多重SNaPshot 反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4 种荧光标记的ddNTP 而最终达到 区分不同SNP 位点的作用, 一次反应可以同时对4-5 个SNP 进行基因分型, 是 一种通量较高的基因分型的方法。 图1 SnaPshot 实验原理图解 2 ．多重SNaPshot 反应的工作通量 工作的进度取决于多重PCR 和EXTENSION 的条件优化过程。还有测序仪的通量也 是很重要的，3730 每天可以 16 次96 道电泳，如果每次出4 个位点，那每天的通 量就是6000 个GENOTYPING，是中等通量的检测。 二.??? SnaPshot 工作流程 精心整理 精心整理 1． 引物的设计 SNAPSHOT 可以检测多重的SNP，我们一般选择4 －5 个位点做一个组合。现对这 些目的SNP 进行引物的设计。每个SNP 设计3 条引物，其中2 条是目的片段的扩增， 长度在200 －500bp 左右，Tm 值在60 度左右。第3 条的引物的是延伸ddNTP,设计 在SNP 位点的上游或者是反向的下游。 引物设计注意事项： 1． 同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6 个碱基。 2 ． 引物与模板互补部分（有效引物）的Tm 值至少要50 C 。 3 ． 为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5’端加poly(dT) 、 poly(dA) 、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成 二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端的 poly(dA)尾巴互补。 4 ． 引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。 引物越短，影响越显着，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距 离。当引物长度小于3