琼脂糖凝胶电泳.pptxVIP

琼脂糖凝胶电泳;⑶ 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。但采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率产生较大的差别，则可达到分离的目的。;琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围;二、仪器设备及材料;三、主要试剂;3、6×上样缓冲液： 4℃贮存 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 30％ 甘油水溶液; 溴化乙锭（EB）染色原理： 溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以 嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激 发下，发出橙色荧光。这是因为： ①在紫外线照射时，核酸吸收波长为254nm 的紫外线并将能量传递给溴化乙锭； ②同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收 302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面 的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可 见荧光。; 溴化乙锭用于核酸染色的优点： ⑴染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml 的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。 也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。;四、电泳操作步骤;3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶 床内，凝胶厚度3～5mm。;8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。;五、注意事项： 1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出。 3、用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免 突然产生气泡，使琼脂糖溢出来。 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固。 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。 6、上样时，加样器吸头要轻贴样品孔壁，但不要 碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。 7、电泳前，确认样品孔位于电场负极。 8、因EB存在，全部操作过程要带防护手套。含EB 的溶液应做净化处理。;感谢您的观看！