冰冻切片实步骤.docx

全部实验步骤 取新鲜组织于 4%多聚甲醛固定 24 小时 30%蔗糖脱水 48 小时以上 -250C 包埋（冰冻切片机内） 冰冻切片冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片 4~8μm，室温放置30 分钟后，入 4℃丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3 次。用3%过氧化氢孵育 5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗，5 分钟×2 次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！以下是我的步骤： 冰冻切片室温放置 30 分钟后，入4℃丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用3％过氧化氢孵育 5~10 分钟，PBS 洗，5 分钟×2。 5~10％正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育 1~2 小时或 4℃过夜。 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育 30 分钟。 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育 10~30 分钟。 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 显色剂显色（DAB）。 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用 3%H2O2/甲醇溶液，室温 20 分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在 9ml 甲醇中加 30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片 4~8mm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用3％过氧化氢孵育 5~10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。 免疫组化染色步骤：（SP 试剂盒为例) 冰冻切片 4~8um，室温放置 30 分钟后，入 4℃丙酮固定 10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用 3％过氧化氢 孵育 5~10 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟×2。 5~10％正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一 抗或一抗工作液，37℃孵育 1~2 小时或 4℃过夜。3 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS 稀释），37℃孵育 10~30 分钟；或滴加第二代生物素 标记二抗工作液，37℃或室温孵育 10~30 分钟。 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS 稀释），37℃孵育 10~30 分钟；或第二代辣根酶标记 链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育 10~30 分钟。 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 显色剂显色（DAB 或 AEC）。 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片 4um 左右，室温 25°C 复温 30min，浸入 4°C 预冷的丙酮固定 10min， PBS（PH 为 7.2-7.4）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约1min 后更换） 用 3%过氧化氢一份，纯甲醇 50 份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。 PBS（PH 为 7.2-7.4，酸性）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约 1min 后更换），甩去 PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm 左右距离，太近会导致边缘效应。 玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA 干燥而导致背景太高，请注意在皿内 玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。 甩去血清，PBS 洗 1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。 配置一抗工作液用 5%BSA（抗体浓度为 1:100），悬空加入一抗工作液 50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。 放入湿盒内，置于 4°C 冰箱过夜（最长不可超过 48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS 清洗浸泡。 第二天上午取出玻片，置常温复温 30min，后PBS 冲洗 1+5+5+5min， 滴加 1:100 生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP 管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育 30min-1h，后PBS 冲洗 1+5+5+5min。 滴加 1:10