标记抗体技术.pptVIP

(二)病毒病诊断 用免疫荧光抗体技术直接检出患畜病变组织中的病毒，已成为病毒感染快速诊断的重要手段。一般可在2h内做出诊断报告。病原的鉴别诊断。 五、免疫荧光抗体技术的应用 第31页，共77页，编辑于2022年，星期一 (二)病毒病诊断 对含病毒较低的病理组织，需先在细胞培养上短期培养增殖后，再用荧光抗体检测病毒抗原，可提高检出率。某些病毒在细胞培养上不出现细胞病变，亦可应用免疫荧光作为病毒增殖的指征。应用间接免疫荧光染色法以检测血清中的病毒抗体，亦常作为诊断和流行病学调查之用，尤以IgM型抗体的检出可供早期诊断和作为近期感染的指征。 五、免疫荧光抗体技术的应用 第32页，共77页，编辑于2022年，星期一 (三)其他方面的应用 免疫荧光抗体技术已广泛应用于淋巴细胞CD分子和膜表面免疫球蛋白(mIg)的检测，从而为淋巴细胞的分类和亚型鉴定提供研究手段。用抗IgM和IgG的抗血清标记SPA荧光菌体作荧光SPA花环试验，可计算带有mIgM或mIgG的B细胞的百分率。 五、免疫荧光抗体技术的应用 第33页，共77页，编辑于2022年，星期一 免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。 1966年，Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术(enzyme-labelled antibody technique)，用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall，VanWeemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。 第2节 免疫酶标记技术 第34页，共77页，编辑于2022年，星期一 一、原 理 酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建起来的免疫检测技术。酶是一种有机催化剂，催化反应过程中酶不被消耗，能反复作用，微量的酶即可导致大量的催化过程，如果产物为有色可见产物，则极为敏感。其催化过程是： E+S (ES) E+P； 或E+S (ES),(ES)+D1 E+P+D2 式中：E为酶；S为酶作用底物；P为底物分解后的产物； D1 为供氢体，无色，底物水解时，D1由还原型变为氧化型D2，呈现颜色反应。 第35页，共77页，编辑于2022年，星期一 酶标抗体技术的基本程序是： ①将酶分子与抗原或抗体分子共价结合，既不改变抗体免疫活性，也不影响酶的催化活性； ②将酶标抗体(抗抗体)与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原(抗体)发生特异性结合，并洗下未结合的物质； ③滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型，呈现颜色反应。 第36页，共77页，编辑于2022年，星期一 可根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的抗原抗体反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗原(抗体)的量呈正比。此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到，或用分光光度计加以测定。这样，就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，用以在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、纳克水平上测定它们的量。本法既特异又敏感，是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。 第37页，共77页，编辑于2022年，星期一 二、用于标记的酶 用于标记的酶应具有如下一些特点：①高度的特异活性和敏感性；②在室温下稳定；③易于获得并能商品化生产；④与底物反应的产物易于显现。常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以辣根过氧化物酶应用最广，其次为碱性磷酸酶。 第38页，共77页，编辑于2022年，星期一 (一)辣根过氧化物酶 过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)。HRP是由五色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白(含糖18％)，分子质量约为40ku。HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，使产生一定颜色的产物。如果联苯胺为供氢体，反应式如下： 二、用于标记的酶 第39页，共77页，编辑于2022年，星期一 凡能在HRP催化H2O2生成H20过程中提供氢，而后自己生成有色产物的化合物(供氢体)都可用作显色剂。 HRP的供氢体很多，根据供氢体的产物可分为两类：①可溶性供氢体：产生有色的可