乙肝标志物ELISA实验规范化操作.pptxVIP

乙肝标志物ELISA实验的规范化操作1. 样品的采集、运输和保存1.1 样品的采集和处理1.1.1 ELISA方法检测乙肝标志物最常使用的是血液标本，临床标本可使用血清或血浆，选用标本种类应满足试剂盒的要求，采集样品应按临床采血技术规范及试剂盒说明书要求进行。1.1.2 血清样品采集和处理采集全血2～4ml,在室温下自然放置1～2h，待血液凝固和血块收缩后用3000rpm离心15min，分离血清备用。1.1.3 抗凝血样品采集和处理用加有抗凝剂（肝素钠或肝素锂）的真空采血管采集全血2～4ml（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，3000rpm离心15min，分离血浆备用。建议使用全自动酶联免疫分析系统的实验室使用血浆样本。1.2 样品的保存 → 48小时内检测可不必分离血清，放2～8℃保存； → 2～7天可分离血清(或血浆)密封置2～8℃保存； → 长期（7天以上）保存应置-20℃以下。1.3 样品的运送 →实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。 →建议采用WHO提出的三级包装系统：第一层容器： →装样品，要求防渗漏。 →样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。 →在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。第二层容器： →要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。 →将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。第三层容器： →放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人）。 →血清和血浆样品应在2?8℃条件下由专人运送(HIV)。2.实验操作2.1准备试剂 在实验开始前，应核对试剂批号、效期，仔细阅读说明书。 将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20min以上后再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡，使温育反应步骤中，反应微孔内的温度较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。实验室使用ELISA试剂盒时需对浓缩洗涤液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。ELISA实验的水质要求达到国家实验室用水一级水标准（GB6682-92）：电导率 ≤0.1us/cm，电阻值 ≥10MΩ/cm，吸光度(254nm,1cm光程) 0.001，可溶性硅(以SiO2计) 0.01mg/L。当试剂盒以OPD为底物时，底物溶液应在反应显色前临时配制。2.2 加样本及反应试剂 →每个检测板均应按试剂盒要求设空白(单波长时)、阴性和阳性对照，并设弱阳性质控血清和阴性质控血清。→加样务必在尽量短的时间内完成，以减少不同孔间的差异。→使用微量加样器加样吸液和排液速度应适当，保证微量加样的准确性和均一性。→要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。 加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。→ 国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加试剂，要注意滴加的角度和滴加速度，避免出现重复滴加或加在两孔之间。→ 加样及反应试剂过程中的特殊情况应记录，便于对实验进行追查分析。2.3 温育2.3.1 保证在设定的温度下有足够的反应时间 → 加完样本和(或)反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，尽快使孔内温度从室温升至37℃ → 水浴箱或温箱的温度应控制在37±1℃范围内，孵育期间尽量不要开启温箱门或水浴箱盖。 → 室温低于10℃的实验室最好选用水浴箱进行孵育，温育中让微孔板浮于水面上。 → 如使用温箱，可将浸透水的纱布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，使反应溶液的温度迅速平衡到孵育环境温度。 → 如果试剂提供两种以上的孵育方式，建议在尽量使用较低温育，温度较长反应时间的方式。2.3.2 “边缘效应”的排除 →孵育时尽量不要将反应板重叠放置，必须重叠放置时，重叠不应超过2块。 →使用水浴是排除“边缘效应”的最好方法。 →在将反应溶液加入至板孔中前，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），也是排除“边缘效应”的方法之一。2.4 洗板 →严格按照试剂盒要求配制洗液，浓度过低会影响洗板效果，浓度过高可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定灵敏度。实验室应使用洗板机进行洗板，洗板机的相关设定应保证适当的注液速度、注液量、浸泡时间、吸液速度和洗板次数，液体残留应尽量少，设定完毕应用空板测试，洗板效果要经过评价。评价实验可按如下方法进行：选择4×8 HBsAg ELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性标本和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第1排4 孔洗1次、第2排4孔洗2次、第3排4孔洗3次……01弱