分子生物学实验课件：4目的基因片段的回收.ppt

实验四 目的基因片段的回收 克隆程序简图 【实验目的】 了解琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的几种方法及其优缺点 学习采用玻璃纤维柱法回收目的片段 已有20余种原始或衍生的方法可供选择，但缺乏高效回收不同大小DNA的普遍实用方法 （1）透析袋电洗脱法 （2）冻融法 （3）玻璃粉法 （4）低融点琼脂糖凝胶法（羟乙基） 低融点琼脂糖法凝胶制备 回收方法的选择 原则： 根据回收片段的大小、现有的试剂与器材、以及后处理的难易等选择合适的回收方法。 产物的纯度 未达标则严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应 产物的回收率 否则增大前期工作量 玻璃纤维柱法快速回收DNA片段 【实验原理】 利用特殊硅基质材料，在一定高盐（消除DNA 和硅基质的负电排斥）缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理（DNA磷酸基团与基质硅烷醇基团形成氢键），配备设计独特的离心吸附柱式结构，快速高效回收DNA片段。 1、电泳分离目的片段(电泳) 酶切样品：每人的酶切样品上一个样品孔(大点样孔) 50μl(或74μl)＋9μl 10 ?上样缓冲液,混匀,Short,上样 DNA marker：5μl DSTM5000 (小点样孔) A1,B1 (50μl样品)回收pET28a中的4.7 kb片段 A2,B2 (74μl样品)回收pEGFP-N3的0.7 kb片段 2、目的片段凝胶的回收(切胶) 紫外灯下切下目的带(本实验室后面) 胶块要尽可能小,尽量控制在100-200μl,否则影响回收率！ 将回收的凝胶切成尽可能小的块,放入EP管中,做好标记 12000rpm离心1分钟 估计胶体积 溶胶:估计凝胶的体积,按照100μl胶加入500μl的溶胶液(Gel-lysis Buffer 溶胶液,6M NaI)65℃水浴溶胶,其间偶尔摇动,至胶完全溶解(熔胶要充分) 漂洗：500μL漂洗液(Washing Buffer漂洗液,含75%乙醇)漂洗,12000rpm离心30秒,去掉废液 重复漂洗：重复漂洗一次,弃废液 干燥：再12000rpm离心2min(离心要充分,彻底去除乙醇) 洗脱:在柱子中央加入120μl洗脱缓冲液(elution buffer)或ddH2O,室温放置2分钟,转入新的EP管中(标记),12000rpm离心1分钟,收集滤液 沉淀:向滤液中加入15μl的3MNaAC溶液,混匀,然后再加入270μl的无水乙醇,-20℃保存备用(下次实验材料) 进行回收电泳时，往往需要在紫外灯下监测。注意应使用长波紫外灯。因为短波紫外线（254nm）会引起DNA链断裂，或是造成基因突变 所有与回收片段接触的试剂及器皿等都应进行灭菌处理，防止DNA酶的污染 回收时的操作要轻柔，特别是大片段，防止机械剪切力对DNA的破坏 【技术关键】 胶块体积尽量小 切胶速度要快 溶胶充分 切忌将凝胶混入样品中 * * 几种回收方法的介绍 回收实验中两个最重要的技术指标 配胶:1%琼脂糖凝胶30mL(0.3g琼脂糖+30ml的1?TAE,熔解后加2μl的Goldviewna) (2人配一块胶,使用2个大齿的梳子) 制样和点样:点样后，等待1分钟，让样品在加样孔中均匀分散 (2人一组,所有酶切样品上样) 电泳:110V电泳1小时至目的带与载体带彻底分开后,停止电泳并照相(对面实验室),忽丢 【实验步骤】 4.0 kb 0.7 kb 4.7kb A1,B1 A2,B2 pEGFP-N3 pET28a 3、目的片段的纯化(纯化) 装柱: 将溶液冷却至室温,装柱(做标记),10000rpm离心30秒,滤液可以重新上柱,重复离心一次后弃滤液 2人一块胶 两人一组 分别回收载体及目的片段 【注意事项】 * * * * *