分子生物学实验课件：5大肠杆菌感受态细胞制备及连接产物的转化.ppt

β- 半乳糖苷酶 乳糖 → 半乳糖 + 葡萄糖 诱导物： 异乳糖 IPTG（异丙基-β- D – 硫代半乳糖苷） 底物： X – gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） 连接产物转化管：4000rpm离心5分钟，吸出弃去800uL上清液后，轻轻混匀菌体，将剩余200uL菌液均匀涂布在Kan平板上。 （注意编号!） 阴性对照分别取100uL菌液涂布一个含Kan的平板 注意：涂棒在酒精灯上烧后需冷却！ 37°C倒置培养过夜。 * 大肠杆菌感受态细胞制备及连接产物的转化 实 验 五 背景理论知识 Section 1 5.1.1 实 验 目 的 掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法 掌握连接产物与质粒转化的方法技术 了解转化过程中各因素对转化率的影响 5.1.2 感受态及转化实验原理 定 义 感受态（Competence)： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程 致敏过程： 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 细菌产生感受态的类型： 自然转化（natural transformation） 在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g. 枯草杆菌） 工程转化（engineered transformation） 在生长周期的特定时刻产生感受态； （e.g .大肠杆菌） 大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变(两种假说)，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。 5.1.2 感受态及转化实验原理 感受态细胞形成的两种假说： 局部原生质体化假说——细胞表面的细胞 壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。 酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶 位点，使DNA分子能进入细胞。 5.1.2 感受态及转化实验原理 5.1.3 制备感受态细胞方法 原生质体法 电击法(需要设备) 特殊试剂诱导法：CaCl2诱导法 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。 CaCl2诱导大肠杆菌形成感受态细胞 在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。 制备好的感受态细胞每100uL分装一支EP管 轻轻混匀----可以用tip头轻轻搅匀. 4℃保存（不加甘油），可保存一周； 加30%甘油，-20 ℃保存，可保存一月； 加30%甘油， -80 ℃保存，可保存六月； 5.1.4 感受态细胞的保存 受体菌: (一般不带特异的筛选标记） E.Coli DH5α, JM109, TG1, BL21, HB101 外源质粒: （一般都带有特异的筛选标记） 根据用途和筛选需要选择: 如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α、JM109、TG1； 用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)。 5.1.5 受体菌与质粒的选择 克隆载体 表达载体 原核 真核 穿梭载体 pGEM-T, pENTR pET28a(+), pGEX, pMAL pcDNA3.0, pEGFP-N3, pRK 重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法： 菌株为某种抗性缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素（Ampr）抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力。 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 互补法： 又称蓝白斑筛选法，质粒上LacZ′基因编码的α肽链与受体菌中编码的β半乳糖苷酶C端突变体互补，形成有功能的β半乳糖苷酶，在特定培养基上显蓝斑，这种现象称为α互补。如果有外源DNA片段插入质粒上的LacZ′基因中，则β半乳糖苷酶失活，显白斑。 5.1.6 重组转化子的筛选 蓝白斑筛选原理 X-gal 蓝色化合物 ?-半乳糖苷酶 Lac-Z基因 蓝白斑筛选: 质粒DNA的转化 + 质粒DNA 420C热击 370C复苏 Amp+筛选 感受态细胞 选择好合适的大肠杆菌菌株、准备好感受态细胞，及相应的筛选培养基之后，就可以