茶叶加工技术：茶鲜叶多酚氧化酶的活力测定.pptxVIP

实验五：茶鲜叶多酚氧化酶的活力测定Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.一、实验目的 ( 1 ) 通过实验,掌握茶叶多酚氧化酶活力的测定方法。( 2 ) 理解酶活力测定常规方法及一般原理。二、实验原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,在一定的温度、pH条件下,有氧存在时,能催化邻苯二酚氧化生成有色物质,单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活力强弱成正相关,即可计算出多酚氧化酶的活力和比活力。三、用具和材料 1.用具 分光光度计、离心机、恒温水浴、研钵或匀浆机、试管、移液管、纱布袋。 2.材料 茶树鲜叶,不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、石英砂、1%邻苯二酚溶液、0.1%脯氨酸溶液、6mol/L尿素溶液、pH6.5柠檬酸-磷酸缓冲液。三、用具和材料 分光光度计离心机恒温水浴三、用具和材料 研钵移液管试管三、用具和材料 茶树鲜叶PVPP石英砂三、用具和材料【pH6.5柠檬酸-磷酸缓冲液的制备】A液:0.1mol/L柠檬酸溶液,称取C6H8O7·H2O(相对分子质量为210.14)21g,加水溶解至1L;B液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液,称取Na2HPO4·2H2O(相对分子质量为178.05)35.61g,加水溶解稀释至1L;取A液84mL与B液116mL混合,即为pH6.5柠檬酸-磷酸缓冲液。四、方法与步骤1.丙酮粉提取酶称取洗净茶树鲜叶或发酵叶10.00g,置于组织捣碎机内,加入80mL冷丙酮、2gPVPP,捣碎5min(分3min+2min两次进行,中间停5min),或者用研钵快速磨成匀浆,然后抽滤,滤渣用80%冷丙酮反复淋洗,洗至滤出液无色为止。所得的滤渣即为丙酮粉,置于冰箱中备用。四、方法与步骤2.匀浆将丙酮粉置于研钵中,加入1:3(体积比)的pH6.5柠檬酸-磷酸缓冲液和少许石英砂,在冰箱中研磨匀浆20min,然后用挤压法和抽滤得粗酶液,在4000r/min离心15min,得清酶液,调至一定体积,供活力测定。四、方法与步骤3.酶活力的测定取酶液1mL于离心管中,加入3mL反应混合液(按照pH6.5磷酸缓冲液:0.1%脯氨酸:1%邻苯二酚为10:2:3,体积比)配制，在37℃恒温水浴中保温10min,立即加入6mol/L尿素溶液3mL(或20%三氯乙酸1mL)终止反应,4000r/min离心10min,取上清液,用10mm比色皿在460nm波长处,在1~2min内测定吸光度值(A),空白对照的反应混合液中的邻苯二酚用缓冲液代替,其他条件相同。酶活力以每克样每钟A460增加0.1为一个活力单位。PVPPPVPP四、方法与步骤五、实验结果计算 茶鲜叶多酚氧化酶活力计算公式： 式中A460----反应中止时以空白为对照在460nm处的吸光度 m----样品干质量g t----反应时间min六、注意事项(1)反应混合液必须现配现用,否则会因邻苯二酚自动氧化而失效;邻苯二酚还可用儿茶素代替。(2)脯氨酸是用作有色氧化产物形成的稳定剂和加速剂。