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基因工程的基本操作程序优质课会计学第1页/共45页1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第2页/共45页一、目的基因的获取1.目的基因符合人们需要，能编码蛋白质的基因2.基因文库 P9 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。第3页/共45页第4页/共45页基因组文库：含有一种生物的全部基因种类部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库第5页/共45页①基因组文库的构建某种生物的全部DNA限制酶DNA片段DNA片段与载体连接重组DNA导入受体菌中储存基因组文库第6页/共45页② cDNA文库的构建-----逆转录法： 生物某个发育时期的mRNA反转录酶单链DNADNA聚合酶双链cDNA片段与载体连接重组DNA导入受体菌中储存cDNA文库第7页/共45页基因组DNA文库与cDNA文库的比较第8页/共45页1，基因组文库内的目的基因：:动物细胞的基因可以在植物细胞中表达真核细胞的基因可以转到真核细胞中表达，原因是受体细胞含有剪切内含子的酶真核生物的基因转移到原核生物中不能得到表达，原因是原核生物不含有剪切内含子的酶。所以说基因组文库中的目的基因在生物间的交流是部分基因可以包括所有的原核生物基因和部分真核基因（取决于受体细胞）2.而cDNA文库中的目的基因是由mRNA逆转录得到的，不含有内含子序列，所以在物种间的基因交流是畅通无阻的第9页/共45页3.获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成第10页/共45页（1）从基因文库中获取目的基因依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性第11页/共45页（2）利用PCR技术扩增目的基因① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。 多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制②原理：__________第12页/共45页模板DNA95℃DNA引物50℃第13页/共45页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理引物1引物2DNA引物72℃第14页/共45页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理Taq酶引物1引物2Taq酶72℃第15页/共45页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第1轮结束第2轮开始95℃50℃72℃第16页/共45页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理TaqTaqTaqTaq72℃第17页/共45页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第2轮结束第18页/共45页③过程：氢键a、变性（90℃-95℃）：双链DNA在受热下，_____断裂，形成________单链DNAb、复性（55℃-65℃）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部________。 双链c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 DNA链第19页/共45页④方式：以_____方式扩增，即____指数2n⑤条件：前提条件:________________已知一段目的基因的核苷酸序列⑥ 结果：短时间内大量扩增目的基因第20页/共45页PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所解旋方式酶主要在细胞核内体外复制解旋酶高温细胞内的DNA聚合酶热稳定的DNA聚合酶第21页/共45页（3）人工合成法： 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学合成法 ,反转录法mRNADNA推测DNA合成仪合成推测第22页/共45页根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：DNA蛋白质二、基因表达载体的构建（核心）第23页/共45页1.目的A. 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代B.同时使目的基因能表达和发挥作用第24页/共45页2.基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因DNA连接酶重组DNA第25页/共45页3.基因表达载体的构建过程质粒限制酶目的基因第26页/共45页限制酶（1）用_________切割质粒，使其出现切口露出____________。（2）用___________切割目 的基因，使其产生_____ ____________。黏性末端同种限制酶相同的黏性末端（3）将目的基因插入质粒的______处，加入___________，形成了一个重组DNA分子切口DNA连接酶第27页/共45页三、将目的基因导入受体细胞------转化目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和___