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p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响 1 1材料与方法 2 3’CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC 3 3’CAGAAGATGGTGGAGGTGTTG 3 文2：p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响医学论文 6 1材料与方法 7 3’CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC 8 3’CAGAAGATGGTGGAGGTGTTG 8 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响 文1：p53和血管内皮生成抑素基因共转染对HL60细胞生长的影响 基因疗法是近年来肿瘤治疗的热点，但效果不理想。原因之一是肿瘤的发生、发展是一个复杂的过程，涉及到多基因的异常以及各种其他因素的作用，单一基因治疗只能作用于肿瘤发生、发展过程中的某一个环节，只有相关的基因共同作用才能更为有效地抑制肿瘤。p53基因是重要的抑癌基因。野生型p53蛋白对细胞周期有重要调控作用，能在DNA受损时促使DNA修复，甚或诱导细胞凋亡。血管内皮生成抑素(angiostatin，AS)对多种肿瘤的生长具有抑制作用，虽然它对肿瘤细胞本身没有直接作用，但可通过抑制或阻断碱性成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)而抑制供应肿瘤组织营养物质的血管内皮细胞的增殖、迁移、并促其凋亡，从而抑制肿瘤组织内新生血管的生成。笔者观察p53、AS共转染对HL60细胞生长的影响，为白血病基因联合治疗提供理论依据。 1材料与方法 材料 细胞(福建医科大学药理学研究所提供)生长于内含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，37 ℃、体积分数为的CO2的饱和湿度培养箱中培养。 携带野生型p53基因、AS基因载体pVITRO2p53Angio(美国Invivogen公司)。筛选抗生素潮霉素(美国Invivogen公司);RNA提取试剂盒Trizol(美国Gibco公司);Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);质粒抽提试剂盒(Qiagen Plasmid Midi，德国Qiagen公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI 1640(美国Gibco公司)。RTPCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)逆转录试剂(美国Promega公司);免疫组织化学试剂(武汉博士德生物工程有限公司) 方法 大肠杆菌 GT116(质粒载体)扩增质粒，按质粒抽提试剂盒说明书操作;设空载体组、p53组、AS组和p53+AS组，分别取pVITRO2、pVITRO2p53、pVITRO2Angio和pVITRO2p53Angio质粒各2 μg，与Lipofectamine 2000 5 μL混匀，静置20 min，加入HL60培养板进行转染;加入200 μg/mL潮霉素筛选，抗性细胞继续培养扩增。 实验取对数生长期细胞以每孔150 mL1的密度接种于24孔培养板，培养2~3周，肉眼可见集落后加Giemsa应用液200 μL染色20 min，流水洗去染液，干燥后计算细胞集落数。 生长期的4种细胞按每孔1 000的密度接种于96孔板上，分别于接种后24，48，72 h，前4 h加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，常温下500 min离心，用酶标仪测定D(490 nm)值，以D(490 nm)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 各组细胞(密度为1×106 mL-1)送流式细胞仪检测，分析细胞周期。 PCR p53: 5’CAGCCAAGTCTGTGACTTGCCGTAC 3’CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC 94 ℃ 3 min(94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s)×30 Ang:5’GAACTACAGAGGGACGATGTCCTC 3’CAGAAGATGGTGGAGGTGTTG 94 ℃ 3 min(94 ℃ 20 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 20 s)×35为引物，进行RNA提取和逆转录，行PCR扩增，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果并拍照。 、bcl2和bax免疫组织化学检测细胞经PBS冲洗、晾干后，加入DAB显色试剂盒中各1滴，经苏木精对比染色，盐酸返蓝，封固，按试剂盒说明书操作。VEGF、bcl2和bax均以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。 统计学处理测定值以x±s