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实时荧光PCR法定量基础上检测食品中鸡源性成分 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：实时荧光PCR法定量基础上检测食品中鸡源性成分 1 1、材料与方法 2 2、结果与分析 5 3、讨论 6 4、结论 7 文2：实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义 7 1　资料与方法 8 2　结果 9 3　讨论 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 实时荧光PCR法定量基础上检测食品中鸡源性成分 文1：实时荧光PCR法定量基础上检测食品中鸡源性成分 在现今的商品经济时代，各种肉食营养价值、销售价格以及生产量、消费量的不同，导致不同源性肉品价格存在巨大悬殊，致使一些不法商贩、企业的违法掺假造假行为时有发生。2013年，欧洲一些肉食品生产商在生牛肉中掺入马肉[1]，曾一度引发社会对食品掺假的舆论谴责。同时，也因疏忽错贴标签而发生一些高商业价值肉制品被误列为低价值肉类的事件[2]。上述事件带来的经济、问题[3，4]越来越受到社会各界的关注。因此，对肉类成分进行物种鉴别，使标签正确化，变得越来越重要。 目前，对于肉类掺假的检测主要是基于蛋白质[5，6]、DNA[7，8，9，10，11，12]以及脂肪[13，14]进行。而蛋白质分析法又包括电泳法[15，16]、色谱法[17]、质谱法[18]、酶联免疫分析法[19]和蛋白质组学法[20]等。这些蛋白质分析方法虽然能够对肉制品成分进行定性、定量分析，但是并不适用于经过高温加工导致蛋白质变性的产品。而DNA在强烈的加热处理后仍能保持稳定性[21]，因此现今多数肉制品成分检测技术都基于DNA检测，其中以PCR技术最常见[22，23]。荧光定量PCR技术因特异性好，检测自动化程度高，已成为现今种属鉴定的主流技术之一。本试验采用TaqMan探针法，参照现行检验检疫行业标准ST2727—2010[24]合成引物及探针，建立鲜肉及加工制品中鸡源性成分的TaqMan实时荧光PCR检测方法，并针对标准进行了试验体系优化和DNA提取方法改进，大大提高了检测效率并且节省了耗材成本。本研究旨在快速、准确检测食品市场中的鸡源性成分，以期为肉制品质量控制提供快速、有效的手段。 1、材料与方法 材料与仪器 原料采集及准备 试验所需鲜肉及加工制品材料，采购于锡林浩特市本地市场及大型超市。样品采集后，除去明显脂肪，并用灭菌水清洗，-20℃冰箱保存。鲜肉样品包括：鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、马肉、驴肉、鹿肉、兔子肉、狗肉、鸭肉、鸽子肉、火鸡肉和鱼肉；加工制品包括：鸡蛋、双汇火腿肠、金锣火腿肠、金锣烤肠、肉粒多猪肉肠、尚清斋烤肠、鸭烤翅、鸭腿、鸭蛋、鹌鹑蛋、蒙羊肉干、呼纳斯牛肉干。 主要仪器与试剂 7300plus实时荧光PCR扩增仪，美国ABI公司；Nanodrop2000c核酸蛋白测定仪，美国ThermoFisher公司；5418R高速台式离心机，德国EppendorfAG公司；凝胶成像系统和T100PCR扩增仪，美国Bio-Rad公司。TratartProbeqPCuperMix，北京全式金生物技术有限公司；qPCR引物和探针合成，北京睿博兴科公司。 方法 引物及探针 根据标准ST2727—2010设计，委托北京睿博兴科公司合成，其中探针所用的荧光标记基团为FAM(6-羧基荧光素）。引物与探针序列见表1。 表1引物和探针序列 DNA提取 ，利用溴化十六烷三甲基铵（cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）法提取DNA[25，26]。方法具体如下：取预先处理好的样品约50mg放入离心管中，加入800μLDNA裂解液，进行旋涡混匀，于65℃金属浴裂解30min，中途取出混匀数次；将金属浴后的管内全部体系置于离心机，13000min离心5min后，转移上清液至新的洁净离心管中；向上清液中加入等体积三氯甲烷/异戊醇（V/V，24/1）混合液，置于涡旋振荡仪上涡旋30s，混匀后13000min离心5min；取上清液于新的离心管中并加入等体积的异丙醇，充分混匀，13000min离心5min，弃去上清；将管内的沉淀用75%乙醇充分洗涤2次，晾干，加入适量的灭菌双蒸水，然后利用Nanodrop2000c核酸蛋白分析仪，测量其浓度及质量，并将样品母液稀释至100ng/μL左右，且使A260/A280在～之间，-20℃保存留用。 反应体系与反应条件 实时荧光PCR平台反应总体系20μL，组分包括：TratartProbeqPCuperMix10μL，左右引物各1μL(10μmol/L），探针1μL(10μmol/L），模板DNA2μL，补充灭菌双蒸水至20μL。反应条