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关于米诺环素下调环氧化酶2抑制砷诱导小胶质细胞活化的实验分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：关于米诺环素下调环氧化酶2抑制砷诱导小胶质细胞活化的实验分析 1 1、材料和方法 2 2、结 果 4 3、讨 论 6 文2：环氧化酶2与肝损伤 8 1　COX-2基因定位与结构特点 8 2　COX-2表达与调节 9 3　COX-2在肝损伤中的作用 10 4　结语 13 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 15 文章致谢（模板） 15 正文 关于米诺环素下调环氧化酶2抑制砷诱导小胶质细胞活化的实验分析 文1：关于米诺环素下调环氧化酶2抑制砷诱导小胶质细胞活化的实验分析 米诺环素是一种临床上广泛使用的抗生素[1，2]，目前常作为一种抑制小胶质细胞活化的药物[3，4]，不仅在动物实验中发挥神经保护作用[5]，还被认为有保持人体大脑清醒，提高大脑警觉性的作用[6]。在中枢神经系统中，米诺环素通过调节环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)影响小胶质细胞活化，而发挥抗炎活性。课题组前期研究发现砷暴露导致小鼠学习和记忆能力下降和小胶质细胞活化，同时上调COX-2表达[8]，因此，米诺环素是否也能通过调控COX-2而影响砷诱导的小胶质细胞活化，引起我们的关注，为解开这个疑问，本研究通过BV-2小鼠小胶质细胞的染毒处理实验观察米诺环素对砷诱导小胶质细胞活化，炎性细胞因子的分泌及COX-2表达的影响，探讨米诺环素抑制砷诱导小胶质细胞活化的可能机制，为临床采用米诺环素治疗环境砷暴露引起的神经系统疾病提供理论依据。 1、材料和方法 细胞株选择及处理分组 BV-2小鼠小胶质细胞(购于上海赛百慷生物技术有限公司)置于37℃的5% CO2孵育箱中，用10%胎牛血清+1%双抗的DMEM高糖培养基培养，待细胞生长至85%～90%时进行传代培养，选用细胞贴壁且生长良好的BV-2小胶质细胞继续培养至对数期后，进行分组染毒处理实验。实验设置4组:对照组(DMEM高糖培养基)，10μmol/L NaAsO2组[9]，10μmol/L米诺环素组[10]和10μmol/L NaAsO2+10μmol/L米诺环素组。 主要仪器与试剂 实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)、CO2恒温培养箱(中国Heal Force公司)，酶标仪(美国Themo公司)，超速低温离心机(美国Sigma公司)，移液枪(德国Eppendof公司)，相差显微镜(日本Olympus公司)，米诺环素、NaAsO2(美国Sigma公司)，胎牛血清、DMEM高糖培养液(美国Hyclone公司)，ELISA Kit、FITC标记驴抗兔荧光二抗(中国博士德生物工程有限公司)，COX-2、β-Actin兔抗鼠单克隆抗体(美国Cell Signal Technology公司)，青霉素-链霉素溶液(双抗，100X)、Real time PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，引物合成(上海生工生物工程股份有限公司) 方法 接种BV-2小胶质细胞，贴壁生长至对数期后，4组分别染毒处理24 h，处理终止后在相差显微镜下拍照。参照小胶质细胞的形态学变化研究，小胶质细胞存在静息和激活两种状态，静息状态细胞呈现梭形或分支状，激活状态呈现脱枝圆形[11]，观察分析不同组别小胶质细胞的静息和激活情况。 ELISA法检测INF-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌 ，收集各组细胞培养液上清，采用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay ， ELISA)试剂盒检测小胶质细胞活化分泌的炎性细胞因子:干扰素-γ(Interferon-γ，INF-γ)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的含量[12] Realtime-PCR分析COX-2 mRNA表达 染毒处理24 h后，采用Trizol分别提取4组BV-2小胶质细胞的COX-2 RNA，检测提取的浓度和纯度。按照实时定量-聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction ，Realtime-PCR)试剂盒说明书操作，引物COX-2上游5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游5′-GCTGTGGTGGTGA AGCTGTA-3′，β-actin上游5′-CAGTAGCATCAAACCGACCA-3′，下游5′-AGTGGAACCATTTCTA GGAC-3′。运用两步法进行