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慢性肾衰竭大鼠Klotho蛋白及mRNA表达受复肾功方的影响研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：慢性肾衰竭大鼠Klotho蛋白及mRNA表达受复肾功方的影响研究 1 1、材料与方法 2 0统计学处理方法 5 2、结果 5 3、讨论 7 文2：食管鳞癌组织中Netrin1蛋白及mRNA的表达 9 1 材料与方法 9 2 结果 10 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 慢性肾衰竭大鼠Klotho蛋白及mRNA表达受复肾功方的影响研究 文1：慢性肾衰竭大鼠Klotho蛋白及mRNA表达受复肾功方的影响研究 慢性肾衰竭（Chronic renal failure，CRF）是在多种慢性肾脏病（Chronickidney disease，CKD）的前提下，逐渐出现慢性肾功能减退直至完全破坏的一种临床综合征，主要表现为水电解质紊乱、代谢产物潴留、酸碱平衡失调以及氮质血症和全身各系统的失衡[1]，是各种肾脏疾病进行性发展的最终结果[2]。慢性进行性肾损害和各种肾脏疾病并发症均可加速CRF病程的进展，而Klotho蛋白与CRF病程进展的关系十分密切[3，4]。Klotho蛋白是一种单向跨膜蛋白和多功能蛋白，其通过膜结合Klotho和可溶性Klotho共同作用，可以减轻和修复肾损伤[5]，但其作用机制还有待进一步研究。 复肾功方（Fushengong decoction，FSGD）是著名中医学家、首届国医大师郭子光教授经过临床60余年总结出的经验方，具有补肾、活血、降浊之功，对于慢性肾功能不全的代偿期、失代偿期（Ⅰ、Ⅱ期）疗效明显[6]。前期实验研究表明，复肾功方可明显改善CRF大鼠肾功能[7]，具有保护肾组织[8]、抑制肾间质纤维化[9]、抗炎[10]等作用。为进一步探讨复肾功方治疗CRF的作用靶点及机制，本研究拟探讨复肾功方对CRF大鼠肾组织Klotho蛋白及mRNA表达的影响，从减轻及其修复肾损伤角度阐释复肾功方延缓CRF进展的作用机制。 1、材料与方法 动物 雄性SD大鼠55只，SPF级，8周龄，体质量（200±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（渝）2018-0003。 药物及试剂 复肾功方由黄芪、水蛭、苍术、黄柏、丹皮、茯苓、车前子、牛膝、生地、山药、山茱萸、杜仲等组成，药材均购自重庆桐君阁大药房股份有限公司，经重庆医科大学中医药学院黄学宽教授鉴定合格后，按照常规中药煎服法浓缩为含生药 g·mL-1的水煎剂[8]。%腺嘌呤饲料购自江苏南通特洛菲饲料公司。兔抗Klotho抗体（批号：10j3131）、兔抗β-actin抗体（批号：82b7184），均购自美国Affinity公司；山羊抗兔二抗（批号：BST13G02A54）、免疫组化试剂盒（批号：13J24K11J1020），均购自武汉博士德公司；Trizol（批号：AHF1819A）、PrimeScript RT reagent Kit（逆转录试剂盒，批号：AI40832A）、荧光定量试剂盒（批号：AI62522A），均购自日本TaKaRa公司；血清肌酐（SCr）试剂盒（批号：）、尿素氮（BUN）试剂盒（批号：），均购自南京建成生物工程研究所有限公司。 主要仪器 BX53型荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；ICEN-24R型离心机，杭州奥盛仪器有限公司；ODYSSEY?FC化学发光仪，美国LI-COR公司；NanoDrop 2000型超微量分光光度计，美国赛默飞世尔科技有限公司；CFX ConnectTMOpticsModule实时荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司。 分组、模型复制及给药 SD大鼠适应性喂养1周后，将其随机分为正常组、模型组及复肾功方低、中、高剂量组，每组11只。正常组给予常规饲养，其他4组大鼠则用腺嘌呤含量为%的饲料建立CRF模型，连续喂养21 d。模型复制结束后，随机抽取4只模型大鼠和1只正常大鼠进行血液生化指标及组织病理形态学检测，以考察模型复制是否成功。模型复制成功后，所有大鼠改用常规饲料饲养。复肾功方低、中、高剂量组大鼠按照体质量分别以含生药4、8、16 g·kg-1复肾功方水煎剂灌胃给药，正常组及模型组给予同体积生理盐水，给药体积20 mL·kg-1·d-1，每日1次，连续灌胃给药30 d。 标本采集 大鼠在末次给药后，禁食不禁水12 h，以20%乌拉坦5 mL·kg-1麻醉，心脏采血3～5 m L；静置1～2 h，以4 000 r·min-1离心10 min，分离出血清，4℃冰箱保存，待测。颈椎脱臼处死大鼠，打开腹腔，分离出肾脏，PBS冲洗肾脏后用滤纸