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口腔鳞状细胞癌生物学行为受三叶青提取物的影响分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：口腔鳞状细胞癌生物学行为受三叶青提取物的影响分析 1 1、材料 2 三叶青提取物制备及干预 2 2、方法 3 3、统计学处理 5 1、不同浓度三叶青提取物对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响 5 2、不同浓度三叶青提取物对口腔鳞癌细胞凋亡相关蛋白的影响 5 3、不同浓度三叶青提取物对口腔鳞癌细胞迁移的影响 6 4、不同浓度的三叶青提取物对口腔鳞癌细胞侵袭的影响 6 5、三叶青提取物对口腔鳞癌细胞侵袭、迁移相关蛋白的影响 6 文2：三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的影响 9 1 材料和方法 9 2 结果 11 3 讨论 12 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 15 正文 口腔鳞状细胞癌生物学行为受三叶青提取物的影响分析 文1：口腔鳞状细胞癌生物学行为受三叶青提取物的影响分析 口腔鳞状细胞癌属于一种常见的口腔颌面部恶性肿瘤，约占口腔恶性肿瘤的80%。目前临床上主要的治疗方法采用手术扩大切除及术后放化疗的治疗方法。有学者提出免疫治疗口腔恶性肿瘤的报道[1]，但是5年生存率在50%左右。研究显示，因不良的生活习惯、吸烟、饮酒及患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移状况等的影响，口腔鳞状细胞癌患者的预后仍不理想[2]。中草药在肿瘤辅助治疗中的作用已越来越被引起重视。三叶青具有清热解毒，活血止痛的功效，主要用于治疗肝炎、肺炎、高热惊厥等，近年来在肿瘤方面作用引起广泛关注[3]。本文旨在研究三叶青提取物对口腔恶性鳞状细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响，以期为临床治疗口腔鳞状细胞癌提供理论支持。 材料和方法 1、材料 细胞株与抗体 人口腔鳞状细胞癌细胞系KB(由AmericanTypeCultureCollection提供)。主要试剂:Bax抗体(型号:bs-0127R，杭州昊鑫生物科技股份有限公司，中国);cleaveCaspase-3抗体(型号:AC030，碧云天生物技术有限公司，中国);cleavePARP抗体(型号:4338-MC-50，艾美捷科技有限公司，中国);MMP-2抗体(型号:XY10373-2，上海信裕生物科技有限公司，中国);MMP-9抗体(YM-CV0379P，上海远慕生物科技有限公司，中国) 三叶青提取物制备及干预 三叶青(上饶红日农业开发有限公司，中国)块根、叶片清洗干净，干燥，在-80℃储存备用。三叶青块根、叶片在60℃烘干处理12h，研成粉末，称取30g，1:20比例先后加入正己烷、乙酸乙酯、80%甲醇，采用超声处理25min，提取溶液，抽滤，通过旋蒸蒸发后，冷冻干燥，浸膏在-80℃环境下保存备用。 2、方法 细胞分组与培养 将细胞分为4组，分别给予不同浓度的三叶青提取物，即0mg/mL组(对照组)，1mg/mL组，5mg/mL组和10mg/mL组。在液氮中取处冻存的口腔鳞状细胞癌细胞系KB，在37℃水浴，进行细胞复苏。 细胞增殖 采用CCK-8检测细胞增殖，将各组细胞在96孔板进行接种，每组为3个复孔，分别培养24h、48h和72h后给予CCK-8试剂检测，每孔中加入20μLCCK-8，继续培养4h后，通过显微镜观察细胞增殖能力，增殖率(%)=(OD实验组-OD对照组)/OD对照组×100% 细胞凋亡 使用Tunel试剂盒，将采集到的单细胞悬液，使用75%酒精清洁细胞计数板和盖玻片后进行晾干备用，在管中使用移液器加入5μL单细胞悬液，之后再加入95μLPBS进行混合均匀，取20μL盖玻片和计数板缝隙一侧匀速缓慢滴下，静置时间为20s，在显微镜下观察细胞凋亡状况，凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数十正常细胞数)×100% 细胞迁移 将细胞加入6孔板中，培养箱中继续培养，铺至90%以上，200μL枪头与横线垂直划痕。使用PBS清洗细胞2～3次，将脱落的细胞清除，加入2mL无血清培养基，在培养箱中继续培养。24h后，倒置显微镜下观察细胞迁移数量。 细胞侵袭 采用使用Trawell试剂盒观察细胞侵袭能力，每组选3个复孔，先用胰酶消化细胞，之后使用PBS缓冲液清洗1～2次，用10g/L的牛血清白蛋白(BSA)重悬细胞，将细胞密度调整至×105个/mL;取150μL细胞悬液加入到Trawell小室中，培养24h，之后乙醇固定5min，使用结晶紫染色，倒置显微镜下计数穿膜细胞。 检测相关蛋白 将采集到的标本10000×g离心处理10min，取出上清液，采用(二喹啉甲酸)蛋白定量法(BCA)蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白定量，将50μg蛋白加入到2×十二烷基硫酸钠