SIRNA抑制PTTG1表达对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭性的影响.docxVIP

【关键词】垂体肿瘤转化基因；rna 干扰；胶质瘤；侵袭 【中图分类号】r739.4 【文献标识码】a 【文章编号】2095-0616（2015）21-09-05 脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，目前以手术治疗为主，辅以放疗及化疗等综合治疗， 但是由于胶质瘤的恶性程度高，呈浸润性生长，与周围正常脑组织无明显分界，易于复发， 并随着复发次数的增加其恶性程度也会不断增加。因此，临床疗效仍不理想。目前胶质瘤研究的重要任务是研究与胶质瘤恶性进展相关的基因，为胶质瘤的诊断和治疗寻找新的途径。垂体肿瘤转化基因（pttg）是 1997 年，pei 等在大鼠垂体肿瘤组织中发现的，其中pttg1 是在 mg63 骨肉瘤细胞中被发现能够抑制分离酶的活性，使姐妹染色体分离受阻，增加使细胞突变机率，从而导致肿瘤的发生发展。pttg1 基因在大多数恶性肿瘤及内分泌相关性肿瘤中均有较高表达，目前研究认为pttg1 基因与抑制染色体分离密切相关，还参与了血管生成，在肿瘤的发生发展及侵袭转移中起到重要作用。本课题组在前期研究中已经证实pttg1 在人脑胶质瘤细胞中的表达较正常脑组织明显增强，并与胶质瘤的恶性程度呈正相关。在本研究中我们应用rna 干扰技术，构建高效沉默pttg1 的 sirna 干扰质粒，并将其转染入胶质瘤细胞u373 中，探讨其对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭性的影响。 材料与方法 实验材料 胶质瘤细胞株 u373（atcc 编号：htb-17），第 5～8 代细胞用于做细胞学实验，dmem 培养基，胎牛血清，大肠杆菌 dh5α 感受态细胞（购于天根生化有限公司），质粒 pgenesil 2 （购买于武汉晶赛生物工程技术公司），rt-pcr 试剂盒，鼠抗人 pttg1 单克隆抗体（购于美国 santa cruz 公司）。 实验方法 胶质瘤细胞的培养 胶质瘤细胞株u373 用 dmem 培养基（含 10%胎牛血清）传代培养，培养条件为 37℃、5%co2、饱和湿度。细胞生长状态良好时进行实验，转染pttg1 干扰质粒的细胞作为实验组，转染非干扰质粒的细胞作为对照组，每种实验方法均选用同一批次细胞进行。 重组pgenesil2 pttg1 sirna 的构建及鉴定 根据genbank 提供的pttg1 cdna 序列（nm-004129），应用 ambion 在线设计软件筛选出 三条 pitg 靶基因序列，分别为 pttg-1：tgggagaql3uaagtiqea；ptfg-2：gtctgtaaagac caaggga； pttg-3：gcatfctgtcgaccctgga，根据上述靶序列设计出三对pttg1 干扰序列。 pgenesil2 质粒经 bamh i 和 hindⅲ双酶切，用 1%琼脂糖凝胶回收大片段。将上述合成的寡核苷酸片段溶解于退火缓冲液（50μ l），分别取正链（2μ l）、反链（2μ l）和退火缓冲液（16μ l），混匀，94℃水浴，3min，自然冷却至室温。用去离子水（99μ l）稀释退火产物 （1μ l），4℃保存。取稀释后退火寡核苷酸链（1μ l），pgenesil2 质粒载体（1μ l），10× ligase buffer（1μ l），加入 t4 连接酶（1μ l），加入去离子水（6μ l），22℃水浴，过夜。取 dh5α （5μ l），涂布于 lb 琼脂平板上（含 kana 抗性），置于 37℃恒温箱内培养。挑取 3个单克隆菌落，接种于 lb 培养液（5ml，含 kana 抗性）中，置于恒温摇床中 37℃培养过夜。用质粒提试剂盒提取质粒。经 sal ⅰ酶切鉴定：将提取的质粒 dna（1μ l），10×h buffer （1μ l），sal ⅰ（1μ l），去离子水（7μ l）混匀，37℃水浴反应 3h，取 5μ l 反应产物，经 1%琼脂糖凝胶电泳验证产物，并将重组质粒菌液送大连宝生物公司测序。 将细胞接种于96 孔细胞培养板中，每孔中细胞数为3×103 个，每孔加入100μ l 培养基， 每种细胞重复 5 个孔，同时设空白对照组（仅加培养基，不加细胞），37℃培养，分别于培养后 24、48、72h 检测各孔吸光度值（od 值），在检测前每孔加入20μ l 的 mtt 继续培养 4h 后弃培养基，加入二甲基亚砜（dmso）150μ l，室温避光孵育 10min，用酶标仪 570nm 测定各孔吸光度值（od 值），绘制生长曲线。细胞生长抑制率（%）=（对照组 od 值一实验组od 值/ 对照组od 值）×100%。 1.2.5 细胞划痕实验实验分为两组，实验组：转染 pttg1 sirna 干扰质粒组，收集 2ml 转染 pttg1 sirna 干扰质粒的细胞悬液接种于 6 孔板，待