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小鼠胚胎干细胞培养实验步骤(3) 第3步――ITSFn培养基 　　在最少量培养基中选择神经前体细胞 　　1.在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基 　　2.并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。 　　3.保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基――大约每隔一天。 　　观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。 　　第4步－N3培养基＋bFGF 　　通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。 　　1.PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶 　　2.37℃孵育5分钟 　　3.用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。 　　4.将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。 　　5.将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。 　　6.2天后更换培养基 　　第5步－N3培养基 　　通过撤除bFGF使神经前体细胞分化 　　1.细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基 　　2.根据需要换液（大约每隔一天） 　　3.分化10～15天后固定细胞 　　移除培养基 　　PBS洗涤 　　加入4%福尔马林 　　室温放置30分钟 　　PBS洗涤2次 　　储存于PBS.长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS 　　移植细胞的准备 　　细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。 　　移植 　　1.将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。 　　细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。 　　2.去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中 　　3.离心3分钟 　　4.去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml） 　　5.37℃水浴5分钟 　　6.加入5mlEB培养基小心吹打约10次 　　小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。 　　7.离心2分钟 　　8.吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基 　　9.用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次 　　10.离心2次 　　11.吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基 　　烟酸己可碱标记ES细胞进行移植 　　1.准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118） 　　2.加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml） 　　3.将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基） 　　4.如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液， 　　5.将悬液置于室温（或冰上）30分钟 　　6.离心2分钟 　　7.吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基 　　8.重复一次 　　9.离心2分钟 　　10.吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。