组织化学技术酶组化.pptxVIP

会计学;2;3;4;5;6;7;〔方法〕 标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片） 厚6微米。 固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃ 2~5′ ①切片标本入下列孵育液中，37℃，5分钟 孵育液： 3％β—甘油磷酸钠 6ml 底物 保 2％巴比妥钠 6ml 调PH 证 2％氯化钙（无水） 9ml 沉淀剂 新 2％硫酸镁 6ml 激活剂 鲜 蒸馏水 3ml 30ml 将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。; ② 流水流水洗2分钟后→入蒸馏水 ③ 入2％硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟） 置换Ⅰ ④ 流水洗5分钟，入蒸馏水。 ⑤ 入0.5硫化胺，2分钟。 置换Ⅱ ⑥ 流水洗10分钟，入蒸馏水。 ⑦ 入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟 ⑧ 流水洗5分钟→蒸馏水。 ⑨ 甘油明胶或Apathy糖胶封固。 ;结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛 纹状缘和 血管内皮出现黑色的硫化钴沉 淀，显示ALP活性强 。 △ ALP为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠 绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、 乳腺及 卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。 〔对照〕 ① 无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3％ β—甘油磷酸钠，其余各步进行同上。;② 加热灭活酶活性。 ③ 加抑制剂，左旋咪唑0.1～1.0mmol/L 〔注意事项〕 ①〔Ca2+〕要足量 ② 硫化钠（NH4）S 配置成淡黄色，可提供 S2-〔滴2～3滴〕 ③ 用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性。 ④ 有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色 素）出现，可影响结果。 ★ 本法可用显示：5—核苷酸酶、肌蛋白 ATPase、ALP ; 二、铅法——显示酸性磷酸酶  （Gomori，1950 Lojda，1979）;第12页/共33页;※ ACP的特性 ① PH 4.5～5.5适宜 ② 激活剂：Mn2+ ③ 抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石 酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。 〔ACP定位〕 ① 溶酶体（??粒状）内； ② 溶酶体外ACP存在于ER和胞液。 ③ 该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、 肾上腺。 ;〔方法〕 标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6 微米。 固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可 用甲醛，但影响活性。 本实验不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1） 混合液，4℃，2～5min 步骤： ① 将标本放于下列孵育液中 37℃， 10～15′ 孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH5.2 15ml 0.24％硝酸铅 15ml; 3％β—甘油磷酸钠 3ml 33ml 混匀，置37℃水浴中15～30分钟后，过滤。 ② 于37℃蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温 蒸馏水洗） ③ 入5％硫化胺，1～2分钟。 ④ 流水冲洗3～5分钟后，换蒸馏水。 （可用Mayer苏木素复染核） ⑤ 用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。 ;〔结果〕酶活性部位→棕黑色硫化铅沉淀。 分布于肾近曲小管细胞核周围，肝