小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案.docVIP

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案 小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方 案 经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。 1. 实验材料与试剂 剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等 试剂配比: (1) DMEM 10:10:1 DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) (2) DMEM 5:5:1 DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S (3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS(DMEM/F12无血清培养基+生长因子) 25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine(腐胺)，5μg/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone(氢化可的松)，20 nM progesterone(孕激素)，1,P / S+生长因子(5ng/ ml的血小板衍生生长因 子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF)胰蛋白酶/ EDTA溶 液0.05,胰蛋白酶+0.02,EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+ ? Laminar flow hood? Dissecting magnifying glass? Water bath at 37oC? Humidified tissue culture incubator (37oC, 5% CO2)? Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps? Orbital Shaker (Boeco OS 20)? Tabletop centrifuge? 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004)? T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787)? Tissue culture plates (Falcon)? Petri dishes (Sterilin)? 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech) 2.实验步骤 2.1星形胶质细胞的混合培养 取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移 入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入 比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反 复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养 基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再 次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存