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(完整版)质粒扩增、提取、转化和转染 (完整版)质粒扩增、提取、转化和转染 质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序 60 质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2 法） 1。 从 LB 平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于 5ml 不加 Amp 的 LB 培养基中， 37℃振荡培养过夜（200r/min,至OD=1.5 左右）。 2。 取 0.5ml 上述振荡过夜的菌液,转入含 50ml 的 LB 的三角烧瓶（1％）中，37℃条件下振荡培养 2~2。5 小时左右（200r/min），使 OD600 达到 0。2～0.4 左右（100μl 测 600nm时OD 值）。 将培养液 50ml 分装到 4 个 10ml 的离心管中，每管 10ml,冰上放置 10min， 4℃条件下,4000r/min 离心 10 分钟，弃上清。将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。 5。 每管加入预冷的 0。1mol/l CaCl2 溶液 2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。转移到一个离心管中，共 8ml。 6。 冰上放置 10min 后，4℃条件下，4000r/min 离心 10min。 7。 沉淀用预冷的 1.6ml 含有 15％甘油的 0.1mol/l 的 CaCl2 溶液悬浮。分装成 200μl 的小份，共 8 管（40ml 变为 1。6ml 浓缩 25 倍）,-70℃保存备用。 二、溶液的配置 1。 LB 培养基：1％蛋白胨（typtone)、0。5%酵母提取物（yeast extract）、1％NaCl，即 10g 蛋白胨，5g 酵母提取物，10g 氯化钠溶解在 950ml 水中，用 1mol/LNaOH 调 PH 至 7。0，在补足水至 1L。高压灭菌 20 分钟备用。 2。 0。1mol/l 的CaCl2 溶液：1.1g/100ml，称取 1。1g CaCl2，加入双蒸水定容至 100ml, 滤膜过滤或高压灭菌，分装成 10ml/小份，4℃保存. 另取 8。5ml+1.5ml 已灭菌甘油,甘油含量为 15％甘油，分装成 1ml/小份（10 份）4℃保存。 配置液体培养基时，高压灭菌 20min 备用； 配置固体培养基时+(1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min.取出后，稍冷却，一个 60mm 的培养皿中加入约 20ml 培养基，无菌条件下铺板。 5。 选择性培养基:培养基+(1。5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌 20min，取出后放于 60OC 水浴，保持 60oc 温度加入 100mg/ml 的氨苄青霉素（Amp)即 100ml LB 加入 100μl Amp(Amp 终浓度达到 50μg/ml），摇匀后铺板(20ml/板）上盖稍打开，37 度烘箱/室温下放置干燥 1-2 天,封口膜包裹后贮 4℃保存备用。 三、质粒转化 注意:取两管感受态细胞①：为空白对照，不加质粒②：加入质粒; 每管加入量：体积10μl,DNA50ng； 质粒稀释成 0。02μg/μl； 200μl 感受态细胞中加入 2μl 浓度为 0。02μg/μl 质粒。具体步骤： 1。 取两管感受态细胞冰上放置解冻，同时质粒冰上解冻，开启水浴锅42oc 管①空白对照，不加质粒； 管②加入 2μl 0。02μg/μl 的质粒，混匀,冰上放置 30min 2. 42℃水浴 90s，不摇 3。 取出，置冰上 2min，加入 LB 300μl,37℃,200r/min 振荡培养 1 小时，复苏细胞. 同时将选择性培养基置于室温 1 小时. 4。 取上述转化菌液 150μl 涂布在相应的培养板上： ⑴不含 Amp 的培养板-—不含质粒菌液 ⑵含 Amp 的培养板-a：不加质粒菌液；b:加质粒菌液 正面培养 1h 后，倒置培养过夜。 观察菌落生长情况，取含Amp 培养板上加入含质粒菌液后生长的菌落，加入到 5ml LB 液体培养基中（加入Amp 5ul),37℃培养 12h. 6。 用含甘油 30%的LB 保存，-70℃ 备用（甘油消毒、高压灭菌）。四、质粒提取 1. 已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的 LB 培养液总共大概 150ml 在 37℃恒温箱中摇菌过夜。 2。 将细菌分装在 4 个 50ml 的离心管中，7000r/min,10 分钟离心，倒掉上清。同时取 10mlP1 溶液加入 10μl 的酶抑制剂，备用。 3. 在每个离心管中加入 1mlP1：酶抑制剂（1:1）,吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中. 4。 加入 5ml 的P2 溶液,轻柔的颠倒 20 次。放置 4 分钟。 一旦加入 P2，应立刻盖上盖子,以防酸化.Genomic DNA 裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过 5 分钟。 5。 加入 5m