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病毒滴度测定 病毒滴度测定 PAGE/NUMPAGES 病毒滴度测定 病毒滴度测定 有很多名词都用来描绘病毒溶液的滴度。 1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位） 2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU近似） 3．PFU（空斑形成单位） 4．TCID50（50%组织培育感染剂量） 不一样的看法缘于不一样的滴度测定方法，这些方法包含2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、 PFU、TCID50）。 1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主 要为DNA），1个OD值相当于×1012个病毒颗粒。用这类方法进行测定在各个实验室中都较 为稳固，但它不可以划分感染性和缺点性病毒颗粒。所以这类方法只好供给病毒的量，至于质， 比方能否含出缺点性颗粒则没有考虑在内。 2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数目。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在 一个感染周期结束前马上测定表达报告基因的细胞。假如重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则能够用这类方法进行测定，病毒保留液平常不用这类方法来进行描绘。 3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培育中病毒裂解空斑的形成。 空斑形成需要很多个感染周期，获取最后结果平常需要三个礼拜。一般来说，这类方法获取 的结果极少能在其他实验室重复，即使在同一实验室内，不一样技术员操作也极少能获取同样 的结果。 4．TCID50已被用于测定很多种病毒的滴度，但从前其实不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞 在96孔板进行培育，而后监测每孔能否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个长处，如速度是PFU的2倍，结果更具料想性，在不一样操作个体间也更稳固。 全部生物学方法所获取的结果在不一样实验室之间常常有所差异，它主要与病毒感染方法有 关。很多要素如加入的病毒积蓄液的量、管子的种类、培育的时间、细胞和培育液的量等都 会影响结果。近来，出现了两种测定病毒滴度的改进方法。一种是用更小体积的病毒液进行 感染并在感染过程中不停晃动培育板（Mittereoler等，1996）；另一种方法例在感染时将 培育板进行离心（1000RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所获取的 结果更加稳固，并证明从前的方法低估了病毒保留液中感染性病毒颗粒的数目。迄今为止， 还没有一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。 关于同一管病毒保留液，不一样的方法所获取的结果常常相差100倍以上，典型的数据见表6。 全部结果都不过大概的，当前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒 /2个颗粒。下一部分，我们将详尽描绘3种不一样的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要 考虑的要点要素包含可重复性、稳固性、敏感性、易用性和耗时。不论选择那种方法，稀释 和滴定过程一定重复操作以获取精准结果。一般来说，用TCID50方法获取的病毒保留液的 滴度应为： 106~107第一代细胞经冻融后 108~109100倍数目的细胞经过冻融后 1010~1011用氯化铯方法纯化后 表6：各滴度测定方法特征 方法种类时间可重复性滴度*评注 VP物理学方法2小时好5×1012 GTU生物学方法2天可变2×1011 PFU生物学方法21天变化很大5×1010传统方法 TCID50生物学方法10天可变×1011昆腾企业标准方法 以VP法测得的5×1012的病毒保留液为标准 5.8.1nm（VP/ml） 这类方法不过经过DNA量来表示病毒滴度。有关系数为×1012/OD260单位。因为大部分分 光光度计在OD值小于时不够精准，而样品准备过程中又最少要稀释10倍，所以假如OD值 大于，我们能够预计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中 的病毒，因含血清培育基会搅乱吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，而且不含缺点性 颗粒。 1．4℃消融病毒保留液。 2．在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（%SDS，10mMTris，1mMEDTH）准备二个病毒稀释 度。 最小需要量为：s 病毒裂解液 病毒 稀释度 52ul 52ul 1 ：2（稀释液 1） 168ul 42ul 1 ：5（稀释液 2） 注意：病毒滴度高时（ 1013/ml）用1：10和1：20 稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD 值在~之间。 3．56℃震荡培育10分钟。0ufgbjf 4．准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白比较溶液， 比率同上，以缓冲液取代病毒裂解液。 5．测定260nm处吸光值： 稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。 稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。 测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的均匀值