第九章免疫标记技术.pptxVIP

第九章免疫标记技术; 高敏感性的标记分子主要有荧光素、酶、放射性同位素,由此建立了免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫分析等技术。 特点:敏感性高、特异性强 应用:微生物鉴定、传染病诊断、生物活性物质的测定、基因表达产物的检测。;第一节 免疫荧光抗体技术; 当发现异硫氰酸荧光素(FITC)被发现后,以及荧光抗体纯化技术的发展,显著提高了荧光抗体技术的敏感性和特异性,故得到广泛应用。 用于病原检测、疫病诊断等;1 原理: 荧光素在超微浓度下,亦能被短波长光激发,在荧光显微镜下可观察到荧光。 是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的敏感性以及显微镜技术的精确性等相互结合的一种免疫检测技术。;2 荧光素 为一种化学染料。常用于标记的荧光素有:异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)、四甲基异硫氰酸罗丹明,其中FITC最常用。 ;作为标记荧光素需满足的条件: (1)有与蛋白分子形成稳定共价键的化学基团,且不形成有害产物。 (2)荧光效率高,与蛋白结合的需要量小。 (3)标记后不影响抗体的活性 (4)性质稳定,易保存 (5)激发的荧光与背景颜色有良好的反差。 (6)标记简单,能形成商品;3 荧光抗体染色方法 (1)标本制备 涂片或亚印片:细菌培养物、感染动物的组织、血液、脓汁 切片:感染组织 盖玻片:上面培养单层细胞 标本要求特别薄,并要保持抗原的完整性;(2)固定 常用丙酮和95%乙醇,室温固定15~30min,后用PBS反复冲洗,干后即可染色。 固定目的:防止被检材料从玻片上脱落;消除标本内抑制抗原抗体反应的因素;检测细胞内的抗原,用有机溶剂固定,有利于荧光抗体渗入。;(3)染色方法 有直截了当法和间接法两种 直截了当法: A 在标本上滴加2~4个单位的标记抗体,置湿盒中,37℃作用30min B 在大量PBS中漂洗15min,;C 干燥 D 封载 滴加缓冲甘油,用盖玻片封盖 检测中,要设阳性、阴性标本对比 缓冲甘油:分析纯甘油9份加PBS 1份 ;直截了当法 猪链球菌2型MRP的鉴定;图2A MRP单抗介导FITC标记SS2表面MRP的激光共聚焦图像; A 在标本上滴加抗SFV血清,置湿盒中,37℃ 作用30 min B PBS漂洗5 min C 加FITC标记的抗抗体,置湿盒中,37℃作用 30 min D PBS漂洗 E 干燥、封载 ;4 荧光显微镜观察 ;(1)细菌学诊断 可直截了当检测或鉴定新分离的细菌,具有较高的敏感性和特异性。 动物粪便、黏膜拭子涂片、病变组织触片或切片、尿沉渣等均可作为样本 对含菌少的样本,可采纳滤膜聚菌法,然后在滤膜上进行免疫荧光染色 ;(2)病毒病诊断 直截了当检测病变组织中的病毒,是病毒病诊断的常用手段。如猪瘟、鸡传支 猪流行性腹泻和传染性胃肠炎,临床症状相似,但将猪小肠做切片,即可区分 关于猪瘟等不出现细胞病变的病毒,免疫荧光可作为病毒增殖的指征 ;(3)其他应用 免疫荧光广泛应用于淋巴细胞CD分子和膜表面免疫球蛋白的检测,用于淋巴细胞的分型;借助于流式细胞计数技术,能够评价机体细胞免疫状况。如佐剂刺激机体细胞免疫功能增强,可通过检测T细胞上的CD表达量来证实 ;第二节 免疫酶标记技术;1971年,Engvall报道酶联免疫吸附试验,建立免疫酶定量检测技术。 1980年后,建立了检测和鉴定蛋白质的免疫转印技术。 ;一、原理; D1为供氢体,无色,底物水解时,D1由还原型变为氧化型D2,呈现颜色反应。;基本程序;体提供氢离子,使供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,呈现颜色反应。 4 依照颜色变化判断反应的发生。 ;二、用于标记的酶;(一)辣根过氧化物酶 广泛分布于植物中,辣根中含量最高,称(horseradish peroxidase,HRP)。。 其作用底物为过氧化氢,催化时需要供氢体。 供氢体主要有:邻苯二胺(OPD)、联苯二胺(DAB)、四甲基联苯胺(TMB) ;OPD的氧化产物可溶解于水,呈橙色,最大吸收波长为490nm TMB 产物溶于水,呈兰色,加氢氟酸终止反应,在650nm测定;用硫酸终止,呈黄色,450nm下测定 DAB的氧化产物不溶于水,呈黄褐色 ;(二)碱性磷酸酶(AKP);三、常用的免疫酶标记技术;3 封闭 10%卵白蛋白(OVA)或0、05%Tween-80和含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS对标本处理30min,能消除背景颜色。 4 染色方法