小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法.pdfVIP

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤 将小鼠的胚胎成纟千维细胞 （MEF）从机体中取出 经胰酶、螯合割（常用 EDTA ）处理，分 f 散成单细胞，置 MEF 生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 —、实验林料准备 1. 翊 孕期 14 至 16 天的孕鼠（小鼠）。 2. 试列 无 Ca2+和 Mg2+的 PBS （D-PBS） 0.05%胰酶、0.53 mmol/LEDTA 溶液、MEF 生长培养 X 基儘糖 DMEM 加 10%FBS） O 3. 器械 眼科直剪 3 把、眼科直镉 3 把、眼科弯镉 2 把、玻璃平皿 3 套、200 目尼龙滤网、50 ml 和 15 ml 离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。 二、具体操作 1. 处死孕鼠，全身置于 75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镉子将孕鼠皮肤剪 开，用另 外一组剪刀、镐子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镐子将子宫小 心取出放在盔 有 D-PBS 的玻璃平皿中，冲洗去血。 2. 用两把弯镐子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个 装有 30 ml D-PBS 的 50 ml 离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉 D-PBS ,再重复此步骤一 次，注意要 留少许 D-PBS ,然后将胚胎转移到另一装有 D-PBS 的平皿中，并用手术刀片 将其细细切碎。 3. 用 200 Ul 的移液枪反复、快速地吹打平 Inl中的液体,转移至 15 ml 离心管中,于 4°C 1500 rpm 离心 5 分钟，倒掉上清，以 Ioml胰酶重悬沉淀，放在 37°C 水浴中消化 30 分 钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。 4. 将上层细胞悬液倒入一个装有 10 ml MEF 生长培养基的 50 ml 离心管中，用 200 目 的尼 龙网过滤后，以 1 500 rpm 离心 5 分钟收集细胞，再用 30 ml MEF 生长培养基洗涤 两次。 8. 细胞长满后,先用 D-PBS 冲洗，倒掉后加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超 过 五分钟）,按 1:5 传代。 9. 细胞再次长到覆盖率 80-90%左右,将其消化后,常规冻存（冻存液要现配）。 注意 1. 原代培养,—走要避免污染。 2. MEF 生存能力有限，如果不冻存,体外存活十代左右。 3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次 因为这些细胞繁殖能力有限。 I 4 消化细胞时间不要过长。 5. 细胞沉淀用 15 ml MEF 生长培养基重悬后进行细胞计数（一般 8 只 14 天的胎鼠可获得 2- 3×107 细胞）。 6. 3xl05 6 7 细胞悬浮于 15 ml MEF 生长培养基中,接种到 200 ml 培养瓶中。 7. 24 小时后更换新鲜的 MEF 生长培养基。